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微生物实验技术讲义

微生物实验技术讲义


开课编号:513041Y 微生物学实验技术 Experiment of Microbiology
课程编号:S071005ZY009 课程属性:专业课 学时/学分:60/1

预修课程:微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学 教学目的和要求:
本课程为微生物学专业研究生专业课,也可作为相关专业研究生的选修课。通过本课 程的教学,训练学生掌握微生物学的操作技能;进一步了解、深化微生物学的基本理论,加 深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识,同时通过实验,培养同学观察、思考、分析问题 和辩证思维能力,为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。

实验一 微生物实验综合介绍(8h) (刘利新)
1. 微生物学实验室安全操作规程讲解 本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》 (WS233-2002),该《准 则》于 2003 年 8 月 1 日实施。规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、 实验室的分级及其基本要求。 本节课将对其中内容进行选择性讲解, 期望对新入实验室的学 生规范化管理起到积极的促进作用。 2. 微生物实验设备综合介绍 3. 细菌、放线菌分离培养基的制备 为保证下节实验课的顺利进行,本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。详细步骤参见 实验二中培养基制备。

实验二 从自然界分离筛选微生物菌种(8h) (戴欣)
一、 实验目的 掌握环境样品微生物分离培养的基本方法,并对分离得到的微生物进行初步分类鉴定 二、 实验原理 自然界中存在着各种各样的微生物, 可以通过人工培养基提供微生物生长所需要的营养 物质,将其中部分微生物从环境中分离出来。不同的微生物对营养要求有很大的差别,明确 这一点非常重要。 培养基配制的基本原理是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成 的一种混合营养物质,一般包括碳源、氮源、无机盐和水。 由于微生物无处不在, 因此培养基在使用之前必须灭菌。 对于大部分培养基而言是可以 通过高压湿热灭菌来实现。 由于微生物核糖体小亚基 RNA 基因功能稳定、 分布广泛且由高变区和保守区相间组成, 是目前广泛应用的微生物分子分类鉴定标准。 本实验通过对微生物的 16S rRNA 基因序列分 析从而对其进行初步分类鉴定。

三、 实验内容及步骤 1. 细菌、放线菌分离培养基的制备

培养基配制的基本步骤: 1) 2) 3) 4) 先在空烧瓶中加入所要配制总量的 50%左右的水 称量培养基各组分 溶化各组分,如需要可搅拌或加热 调 pH,定容

5) 6)

分装。如需配制固体培养基可加入 1.5%琼脂粉 高压蒸汽灭菌:一般选择 121℃/20min,但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择 115℃/20min。

R2A 培养基(细菌用) : 酵母提取物:0.5g;蛋白胨:0.25g;酪氨酸:0.75g;葡萄糖:0.5g;淀粉:0.5g;磷酸 氢二钾:0.3g;硫酸镁:0.024g;丙酮酸钠:0.3g;加水稀释至 1L,调节 pH 至 7.5-7.8,琼 脂 15g,115℃灭菌 20 分钟后倒平板; GYM 培养基(放线菌用) : 酵母提取物:4g;麦芽糖:10g;葡萄糖:4g;碳酸钙:2g;加水稀释至 1L,调节 pH 至 7.5-7.8,琼脂 15g,115℃灭菌 20 分钟后倒平板。 2. 样品的采集和保存 采集用具和样品放置容器严格灭菌处理,防止样品污染。 微生物分离培养样品短期可 4℃保存,长时间存放最好冷冻保存。 3. 微生物分离培养

微生物的分类培养要特别注意无菌操作,无菌操作基本环节如下: 1) 2) 3) 4) 接种室或超净台要保持清洁,用前使用紫外灯灭菌 接种的试管、三角瓶等要做好标记,避免弄混。接种使用的枪尖等要做灭菌处理 接种前双手要用 70%酒精消毒,并避免直接接触样品 培养箱注意清洁,并经常消毒

首先根据对样品中微生物生物量的估算,按梯度稀释样品, 一般制备原液、 -1~10-7 稀 10 释液;如果样品生物量较低,也可选择浓缩样品或经液体培养基富集培养样品中的微生物; 然后取 100ul 稀释(或浓缩)样品液或富集培养物涂布于分离培养基上,28℃(或样品

采集环境温度)倒置培养 3~5 天。 特定微生物的分离培养:根据微生物的营养需求选择性添加营养元素来富集特定微生 物、模拟微生物的特定生境(如人工海水或者高温、低温培养) 、利用微生物的某些降解活 性(如纤维素降解活性)分离特定微生物等 4. 微生物菌株纯化与保存 将长出的菌株挑取在新的培养基上进行划线纯化,一般重复 2-3 次以上; 将纯化后的菌株可转至试管斜面培养后置于 4℃短期保藏, 也可经液体培养后添加保护 剂(甘油、二甲基亚砜、脱脂奶粉等)置于-20℃或-80℃长期冻存。 5. 纯化菌株的(分子)鉴定 首先对得到的菌种进行液体培养至对数生长期,离心收集菌体,采用细菌 DNA 提取试 剂盒提取细菌的总 DNA。 然后使用细菌 16S rRNA 基因通用引物进行 PCR 扩增,扩增条件:94℃ 4min, 94℃ 1min,55℃ 1min, 72℃ 2min, 30 个循环后 72℃ 10min,至 4℃停止。PCR 产物经电泳检 测和 PCR 产物纯化试剂盒纯化后送公司测序, 通过 BLAST 将获得的序列与 GenBank 数据 库中序列进行相似性比对,初步鉴定菌种的类群。 16S rRNA 通用引物如下: 27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3' 1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC 3'

实验三 厌氧微生物的培养(8h) (佟卉春)
一、 实验目的 熟练掌握微生物的厌氧培养方法;观察菌体、菌落形态特征,并测定其生长曲线。

二、 实验原理

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌,必须创造一个无氧的环境。通常用 培养基中加入还原剂,或用物理、化学方法去除环境中的游离氧,以降低氧化还原电 势。 目前培养厌氧微生物的技术包括:亨盖特厌氧滚管技术,厌氧手套箱培养技术, 及厌氧罐/袋培养技术。

三、 试剂与器材 1. 器材:普通光学显微镜,需配 100 倍放大的物镜,恒温培养箱,可见光分光光度计,超 净工作台,制冰机,恒温水浴锅,电磁炉,医用瓷托盘:25cm X 16cm,载玻片(最少 每人 1 张) ,一次性 1ml 注射器(大约 300 支)1ml 比色皿(玻璃材质即可,每组或每 人一个) ,厌氧管及配套塞子:500 支,2.5L 厌氧培养罐:5 只,适用于 2.5L 厌氧培养 罐的厌氧产气袋:1 包,每包 10 只,直径 9cm 标准培养皿(最少 80 只) 2. 试剂:革兰氏染色试剂(应最少可染 30 张片子) ,BHI 肉汤(Difco 公司) :500 克国产 琼脂:500 克,75%酒精棉球

四、 实验内容及步骤 以链球菌为例,进行纯度检查,厌氧培养及生长曲线测定。 1. 2. 纯度检查:涂片、革兰氏染色、及显微镜下观察细菌形态及纯度。 接种及厌氧培养:

1)预还原无氧培养基制备(演示) :培养基配制;分装,3ml/管;抽气换气法制造厌氧环境: 先用真空泵抽成负压 99.99kPa 750mmHg) 然后充入无氧氮气, ( , 反复 4 次, 最后充入 80%N2、 10%H2 和 10%CO2 的混合气体;高压蒸汽灭菌。 2)接种及厌氧培养:将过夜培养的链球菌以 1:20 的比例接种到新鲜的预还原的厌氧培养 基中,37℃温箱培养,每隔 1 小时取 1ml 样品,用分光光度计测定其在 600nm 处的光吸收

值,记录并绘制生长曲线。 3. Hungate 厌氧滚管

1)实验菌种系列稀释:将实验菌种 10 倍系列稀释。用无菌注射器吸取 1ml 原液至另一支 装有 9ml 培养基的试管中,制成 10-2 稀释液。按此操作方法依次进行 10 倍系列稀释,制成 不同浓度的样品稀释液。取适宜稀释度的样品进行厌氧滚管。 2) 厌氧滚管:将预先配制的装有 2.7ml 无氧琼脂培养基的试管置于沸水中融化, 放置于 55℃ 左右的恒温水浴中, 1ml 无菌注射器分别吸取适宜稀释度的稀释液各 0.3ml 于融化了的琼 用 脂培养基试管中, 而后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动, 培养基在试管内壁立即凝固成 一薄层。 2)37℃温箱培养,24 小时后观察并记录菌落形态。 4. 厌氧罐培养

1)实验菌种系列稀释:将实验菌种 10 倍系列稀释,取适宜稀释度的样品涂布平板。 2)将平板置于厌氧罐中,厌氧罐由透明的聚碳酸酯或不锈钢制成,盖子内侧有金属网状容 器, 用于装厌氧指示剂美蓝和用铝箔裹封的催化剂钯粉。 然后将气体发生袋放入容器密封后, 容器内的氧气在 0.5~1 小时内被完全吸收,同时产生等量的二氧化碳。 3)37℃温箱培养,24 小时后观察、记录菌落形态,并计数菌落数目。

实验四 生长谱法选育营养缺陷型菌株(8h) (何秀萍)
一、 实验目的 理解营养缺陷型菌株的选育原理及用途,掌握筛选营养缺陷型菌株的方法。

二、 实验原理 营养缺陷型菌株是指由于基因水平上的变化, 使细胞缺失有功能的某种蛋白质 (多数为 酶) ,造成代谢途径的阻断,不能合成某种必需的代谢产物,只能在营养丰富的完全培养基 或外源添加被阻断合成的物质的基本培养基中正常生长的一类菌株。 利用物理、 化学或生物 学手段使特定代谢途径中关键酶基因发生突变, 并结合有效的筛选方法, 就可以获得特定的 营养缺陷型菌株。营养缺陷型菌株被广泛应用于代谢调控及代谢工程改造中解除反馈抑制, 使中间产物或分支途径中终产物大量积累,如氨基酸、维生素、核苷酸等。同时营养缺陷型 也是遗传学研究、传统微生物育种技术(细胞杂交和原生质体融合)及基因工程中应用最为 广泛的遗传筛选标记。

三、 实验内容及步骤 1、实验材料 (1) 菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (2) 培养基及试剂 酵母菌完全培养基(YPD):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉,溶于蒸馏水,自然 pH。 配置固体培养基需加入 1%琼脂粉。8 磅灭菌 30min; 酵母菌基本培养基(SC):0.67% (Yeast Nitrogen Base, Difco),1%葡萄糖,溶于蒸馏水,自然 pH。配置固体培养基需加入 1%琼脂粉。8 磅灭菌 30min; 其他试剂:0.25 g/L 尿嘧啶、1g/L 色氨酸、0.35g/L 组氨酸、0.3g/L 亮氨酸、0.3g/L 赖氨酸。 2、方法和步骤 (1) 诱变后菌液处理:诱变后细胞悬浮液进行 10 倍的梯度稀释,然后涂布在 YPD 固体培养 基平板上,30℃ 温箱培养 48 h; (2) 营养缺陷型突变株的检出:将 YPD 平板上长出的单菌落挑到装有 1ml 无菌水的小试管

中制成菌悬液, 室温静置 4 h; 分别取一接种环菌悬液点接于 SC 和 YPD 固体培养基上, 30℃ 温箱培养 48 h;在 YPD 固体平板上能够生长,在 SC 固体平板上不能生长的就是可 能的营养缺陷型菌株; (3) 营养缺陷型的鉴定:通过在基本培养基 SC 中补充不同的营养元素,检测细胞生长情况, 确定突变菌株具体缺失了那种物质的合成能力。一般先进行大类的鉴定,如氨基酸、核 苷酸或维生素等营养缺陷型;然后对大类内部各物质缺陷型进行具体的鉴定。 营养缺陷型大类的鉴定:将可能的营养缺陷型细胞转接到无菌水中,5000 rpm 离心 5 分 钟离心收集细胞, 用无菌水洗两次, 重悬于无菌水中, 使细胞浓度约为 106 个/ml, 1ml 取 菌悬液,与融化后冷却到 45-50℃的 15 ml SC 固体培养基充分混合,倒入培养皿中,凝 固后,将培养皿底部划分为三个区域并做标记,然后在平板里的三个对应区域分别贴上 蘸有氨基酸混合液、维生素混合液、碱基混合液的滤纸片,30℃温箱培养 48 h,根据在 滤纸片周围是否出现微生物生长圈,确定突变株属于哪一大类的营养缺陷型; 营养缺陷型的具体确定(以氨基酸缺陷型为例) :按照每次缺少一种氨基酸的策略,制备 含有不同氨基酸组合的 SC 固体培养基平板;将 YPD 斜面上培养的细胞接一环于无菌水 中,室温静置 4 h,然后将菌悬液分别对应点于上述不同的固体平板上,30℃温箱培养 48 h,在缺少了某种氨基酸的培养基上不能生长的突变株即为该氨基酸的营养缺陷型菌 株。

四、 思考题(可有可无) 在营养缺陷型菌株的检出和鉴定过程中, 将细胞接于无菌水中, 室温静置 4 h 的目地是 什么?

实验五 乳酸测定及酸乳制备(8h) (钟瑾)
发酵液乳酸含量的测定
乳酸是一种重要的食品添加剂, 乳酸钙、 乳酸锌、 乳酸铁等衍生物是重要的药品; 同时, 乳酸也是合成新型可降解材料聚乳酸(PLA)的单体物质,因此,乳酸一直受到国内外研究者 的广泛关注。现有的乳酸定量测定方法,包括对羟基联苯法、高效液相法、气相色谱法、酶 法等。本实验采用特异性好、灵敏度高的对羟基联苯法测定发酵液中乳酸的含量。

一、 实验目的 1. 2. 掌握发酵液中乳酸含量的测定方法。 了解不同样品环境下乳酸含量的测定方法。

二、 实验原理 乳酸在铜离子的催化下,与浓硫酸作用生成乙醛,乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内,乳酸含量与 565 nm 处吸光度呈线性关 系,因此可以通过测定 565 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。

三、 实验内容及步骤 1. 发酵液样品预处理 取适量发酵液样品 5000 r/min 离心 10 min,以除去菌体和碳酸钙沉淀,取上清液适当稀 释,吸取稀释液 2 mL 于洁净离心管中,加入 2 mL 钨酸溶液,混匀,室温静置,直至溶液 中出现明显絮状物,10000 r/min 离心 10 min,取上清液置于 10 mL 洁净离心管中,60℃水 浴保温 30 min 左右,冷却待用。 2. 吸光度测定

精确吸取 5 mL 待测液于 10 mL EP 管中, 加入 0.05 g 氢氧化钙, 混匀, 然后加入 0.8 ml 20%硫酸铜,迅速混匀,沸水浴 3 min,水浴冷却,3000 r/min 离心 5 min,取上清液 0.5 mL 加入比色管中; 加入 6 mL 浓硫酸, 混匀, 沸水浴加热 5 min, 取出后冰水浴冷却; 加入 1.5% 对羟基联苯溶液 0.125 mL,充分混匀,静置 15 min;置于沸水浴中加热 5 min,冰水浴冷却, 以蒸馏水为参比液,在 565 nm 处测吸收。 3. 标准曲线的制作 0.5 mg/mL 乳酸标准液与发酵液同样预处理后,取 0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、 0.45、0.50 mL 处理液,分别加进 8 支预先编号的试管,再用蒸馏水补足体积至 5 mL,按上 述步骤操作,分别测定吸光度。以乳酸含量为横坐标,吸光度为纵坐标作图得到标准曲线。 4. 利用标准曲线所得的回归方程,结合样品的吸光值,计算样品中乳酸的含量。

酸乳的制备
酸乳是以鲜乳为主要原料,经过预处理,然后接种乳酸菌(例如,保加利亚乳杆菌,嗜 热链球菌等)作为发酵剂,并保温发酵一定时间,使乳中蛋白质凝结的一种乳制品。酸乳中 的蛋白质更易被机体合成细胞时所利用, 具有更好的生化可利用性, 含有更多的易于吸收的 钙质和丰富的维生素,减轻“乳糖不耐受症”;同时,酸乳成品中含有大量的活性微生物,能 改善肠道菌群,抑制致病菌的生长繁殖,增强免疫,刺激肠胃蠕动等。 一、 实验目的 1. 2. 学习实验室制作酸乳的方法。 了解酸乳制品质量(酸度和乳酸菌含量)的检测方法。

二、 实验原理 利用乳酸菌发酵牛奶中的乳糖,产生大量的乳酸,使酪蛋白变性凝固,而使整个奶液呈

现凝乳状态。

三、 试剂与器材 1. 2. 器材:天平,恒温水浴锅,恒温培养箱,无菌操作台,灭菌的三角烧瓶(250 mL) 试剂:牛奶,酸乳,蔗糖

四、 实验内容及步骤 1. 将市售牛奶 100 mL 加到 250 mL 的三角烧瓶中,再加 5 g 蔗糖,摇匀,用无菌封口膜封 好瓶口; 2. 三角烧瓶放入 80℃的恒温水浴锅中,不时摇动,保持 15 min,然后立即从水浴锅中取 出,用冷水冲洗其外壁,使巴氏消毒奶冷却至 45℃; 3. 4. 5. 6. 将市售酸乳按 5%-10%接种量,加入上述三角烧瓶中,充分摇匀,盖好封口膜; 将三角烧瓶放于 40-42℃的培养箱中发酵 6-8 h, 当发酵奶出现凝固状时,停止发酵; 接着将三角烧瓶放在低温(4-6℃)下后熟,持续 24 h 以上,这样就得到酸乳成品了; 对制备的酸乳进行乳酸菌活菌计数和酸度的测定(略) 。

酸乳中乳酸菌活菌计数
一、 实验目的 1. 2. 学习利用稀释涂布平板法对样品中的活菌进行计数。 了解乳酸菌的培养过程。

二、 实验原理 平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而 成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀

释, 再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中, 使其均匀分布于平皿中的培养基内, 经培养后, 由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含活菌数。

三、 试剂与器材 1. 附:GM17 固体培养基配方(1 L) 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖 维生素 C 5g 5g 5g 5g 0.5 g MgSO4.7H2O 琼脂粉 酵母提取物 0.25 g 15 g 2.5 g

β 磷酸甘油二钠 19 g

四、 实验内容及步骤(需无菌操作) 1. 编号 一个样品,取无菌平皿 3 个,分别标明 10-7、10-8、10-9。另取 6 支离心管,依次标明 -1, -3, -5, -6, -7, -8,分别加入 900, 990, 990, 360, 360, 360 μL 的生理盐水。(提前一天倒好平 板,标号和稀释液预先准备) 2. 重悬及稀释 用移液器精确地吸取酸乳 100 μL 加入-1 号离心管中, 另取枪头来回吹吸使其混合均匀。 自-1 号离心管吸取 10 μL 放入-3 号离心管中,混匀。由-3 到-5 经同样的操作。接下来的梯 度稀释过程如下:即 40 μL-5 号离心管加入-6 号,40 μL-6 号离心管加入-7 号,40 μL-7 号离 心管加入-8 号中,操作同上。 3. 涂布平板 分别从-6,-7,-8 离心管中吸取 100 μL 菌液,涂布到已倒好培养皿中,涂布均匀,待 菌液渗透后,倒置于 37℃恒温培养箱中培养。

4. 计数 培养 24 小时后,取出培养皿,并按下列公式进行计算: 每 mL 酸乳中总活菌数= 菌落数 × 稀释倍数 ×100 五、 一般选择每个平板上长有 30—300 个菌落的稀释度计算菌落数最为合适。在这个范围 内,各

实验六 动物病毒的鸡胚培养(8h) (严景华)
一、 实验目的 了解流感病毒在鸡胚尿囊腔中的增殖过程; 掌握流感病接种毒鸡胚的方法和途径及流感病毒收获的方法; 掌握红细胞凝集实验的操作方法及结果判定; 掌握 RT-PCR 检测流感病毒的原理和方法 二、 实验原理 鸡胚是正在发育的机体, 它的组织分化程度低, 许多病毒在鸡胚中都能适应繁殖而且从 感染病毒的鸡胚中可以收获大量病毒,此外,鸡胚接种操作简单,现有的鸡胚来源充足且是 SPF,对接种病毒不产生抗性。因此常用来进行病毒的分离、培养以及毒力的测定,中和试 验和制备疫苗等。 鸡胚是流感病毒培养和疫苗生产的重要材料。 因此, 本实验将利用流感病毒为材料学习 动物病毒鸡胚培养技术。流感病毒的检测通常采用细胞凝集实验和 PT-PCR 的方法。流感病 毒颗粒膜蛋白 HA 蛋白可以识别和结合宿主细胞表面的含唾液酸的糖蛋白和脂蛋白, 鸡血红 细胞表面均含有此种蛋白, 因此它能够被流感病毒识别并结合发生红细胞凝集现象。 流感病

毒 8 个基因片段 5’和 3’非编码区都含有一段保守序列,因此可以通过设计通用引物扩增流 感病毒基因片段。

1.

尿囊腔接种流感病毒

1.1 活胚检查 购买 9-11 日龄的鸡胚,在使用前进行检查。首先,活胚的血管明显可见;其次,活胚 有明显的胎动,尤其在轻轻转动时可见脐带活动;最后,良好的鸡胚可见密布血管的绒毛尿 囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线 。 若鸡胚血管模糊甚至不见、 胎动不明显或没有、 绒毛尿囊膜界限模糊,则可判断鸡胚濒死或已经死亡。 1.2 接种 照检后,在胚胎面与气室交界边缘处避开血管做标记。在标记周围用先用 2.5%碘酒消 毒,再用 75%酒精脱碘,在标记以上约 1mm 处打孔。用注射器抽取要接种的病毒液,垂直 插入约 1cm,注射约 0.1-0.2ml 病毒液,用融化的石蜡封口。 1.3 后期观察 将接种后的鸡胚置于孵箱中继续培养,每日照检一次。在 24 小时内死亡的鸡胚为非特 异性死亡应弃去。鸡胚在 24-72 小时内死亡后应及时收取尿囊液。在 72 小时仍未死亡的鸡 胚置于 4℃ 6 小时或过夜,或者置于-20℃ 1 小时,目的是致死鸡胚使血液凝固。 1.4 收获 用碘酒消毒,再用 75%酒精脱碘。将气室上方的卵壳敲碎并取走,用镊子等按压胚胎 同时将尿囊液吸出置于无菌管中,并离心。 2. 血凝检测

2.1 实验前准备 1% 鸡红细胞悬液:将采取的鸡血(含阿氏液未凝血)转移到离心管中,用 PBS 稀释,1500rpm 离心 10min,弃掉上清和白细胞,留取红细胞,重复 3 次;最后用 PBS 配成 1% 鸡红细胞悬液,置于 4℃; 2.2 在 96 孔血凝板中加入 25 μL PBS/孔,在第 1 列加入 25 μL 病毒液,混匀,吸取 25 μL 混 合液加入到第 2 列中,混匀,以此类推,倍比稀释病毒液。稀释到倒数第 2 列时,混匀弃掉 25 μL 混合液。最后一列作为阴性对照,不做任何处理; 2.3 每孔加入 25 μL 1%鸡红血细胞。相混后置于室温,25-30 min 时观察血细胞的凝集情况。 一般来说,将血凝板直立,若血红细胞呈泪滴状流下说明无病毒,若血细胞弥散在整个孔中 则有病毒。 3. RT-PCR 检测流感病毒 3.1 病毒 RNA 提取 取 100ul 鸡胚扩增的流感病毒,按试剂盒说明书( QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取病 毒 RNA。 3.2 反转录 取 5ul RNA, 70℃ 5 分钟, 冰浴 2 分钟。 按试剂盒 Reverse Transcription System, ( Promega) 说明书配制反应体系,室温放置 10min,42℃反应 1 小时。 3.3 PCR 取 1ul 反转录 cDNA 做模板,加入 M 基因通用引物,进行 PCR 扩增。扩增条件:预变 性 95℃ 5min,循环参数:94℃ 1min, 55℃ 1min, 72 2min, 30 循环。 3.4 PCR 产物鉴定 取 10ul PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(1% 琼脂糖凝胶) 。凝胶成像仪观察结果。

实验七 固定化枯草芽孢杆菌连续发酵生产 α 淀粉酶(8h) (钞亚鹏)
一、 实验目的 了解固定化细胞和固定化酶的基本原理和方法; 掌握运用物理包埋法固定枯草芽孢杆菌 的技术以及连续生产 α-淀粉酶的实验过程。

二、 实验原理 聚乙烯醇/海藻酸钠/细胞混合溶液在氯化钙/硼酸混合液中可以形成不同粒度的球形颗 粒,这种颗粒有一定的硬度、韧度和孔径。同时具有生理活性的细胞被固定在这些颗粒里。 当给予适当的生长或反应条件时,细胞可以不断的分泌人们所需的蛋白、酶、以及各种代谢 物,或者将外源底物催化转化成目的产物。在反应结束后,固定化细胞可以方便的从反应体 系中分离出来, 经过适当的处理后用于下轮反应。 固定化细胞最大的特点是高效性和可以重 复使用。

三、 试剂与器材 1. 器材:超净工作台、培养箱、分析天平、灭菌锅、微波炉,磁力搅拌器,磁转子,分光 光度计,水浴锅。500ml 三角瓶 10 个,250ml 三角瓶 1 个,小试管约 50 支、大试管 10 支、10?l, 100?l 、200?l ,1ml,5ml 移液枪各一支及其相配套的枪头盒,1000ml 烧 杯 5 个,药匙 3 个,500mL 量筒 1 个,棕色瓶 1 个,带盖试剂瓶 1 个,洗瓶 1 个,注 射器,比色皿 3 个。 2. 试剂:聚乙烯醇,海藻酸钠,氯化钙,硼酸,可溶性淀粉,浓盐酸,碘化钾,碘

四、 1.

实验内容及步骤

枯草芽孢杆菌发酵培养及菌体收集

在牛肉汁斜面上划线活化枯草芽孢杆菌一次。 然后将斜面种子接种于牛肉汁液体培养基 (500ml 摇瓶装液量 100ml,共 10 瓶) ,37? 振荡培养过夜。离心收集菌体(6000r/min, C 15min) ,用生理盐水洗涤 1 次,后将细胞悬浮于 50ml 生理盐水中。 2. 固定化细胞过程 10%聚乙烯醇+1%海藻酸钠溶液 50ml,加入 5ml 处理好的菌悬液(载体:菌悬液=10: 1) ,混匀,温度控制在 40℃左右,然后用注射器滴加到冷却的含有 2%氯化钙和 4%硼酸溶 液中,边滴加边搅拌,室温交联 4 小时,4℃下硬化 16-20 小时,取出用无菌水洗涤后待用。 3. 利用固定化细胞发酵生产 α 淀粉酶 取适量的固定化细胞颗粒置于 500ml 摇瓶中,加入 100ml 新鲜无菌的牛肉汁培养基, 37? 振荡培养 2h 以上,取上清液测定淀粉酶活性。 C 4. 淀粉酶水解活性测定方法:

预先配制 0.1mol/L HCl 溶液和 0.1mol/L I2 液: 0.1mol/L HCl 溶液:取 4.95mL 的浓盐酸,加水定容到 500mL,放入试剂瓶中保存 0.1mol/L I2 液:称取6.5g碘及17.5g碘化钾,溶于少量水中,然后移入500mL棕色试剂瓶中, 加水稀释至500mL,用磁力搅拌器搅匀。用时稀释100倍。 配制质量分数0.25%(w/v)的可溶性淀粉溶液,煮沸。将各试管标号,先向各试管中分别 加入0.4mL 0.25%可溶性淀粉溶液,然后于40℃恒温水浴预热15min。然后向各试管中加入 0.1mL适度稀释的酶液(用蒸馏水稀释) ,对照组在加酶之前先加入0.1 mol/L HCl 溶液 1.5mL,混匀,然后置于40℃恒温水浴反应10 min。反应10min后,取出各试管,立即向实验 组补加1.5 mL 0.1mol/L HCl溶液,然后向各试管中均加入3 mL 1mmol/L I2 液及5 mL 蒸馏 水,混匀,迅速于700 nm处测定OD值,用蒸馏水作为空白调零,记录数据。 在上述条件下定义,以每分钟降低10%吸光度所需的酶量定义为1个酶活力单位。

按以下公式计算酶活:酶活单位(U/mL)=(a-b)/a× 100× 酶液稀释倍数 式中:a为对照组的 吸光值,b为实验组的吸光值;

五、 思考题(可有可无) 固定化酶技术大体有哪几种?在新型微加工技术不断发展的今天,固定化酶的技 术、固定化酶颗粒尺度、固定化酶的性能有何新的进展?

实验八 实验结果总结、分析(4h) (全体老师)
主要参考书:
1、赵斌、何绍江《微生物学实验》科学出版社 2002 年 2、沈萍、范秀容、李广武《微生物学实验》第三版 高等教育出版社 1999 年 3、钱存柔、黄仪秀《微生物学实验教程》北京大学出版社 1999 年 4、黄秀梨 《微生物学实验指导》高等教育出版社 1999 年

教学方式:实验室讲解,实验 考核方式:实验报告

撰写人: (国科大生命科学学院)刘利新 撰写日期:2011 年 11 月 修改日期:2012 年 12 月(全体授课教师)



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