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基因工程载体

基因工程载体


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基因工程载体

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一、载体概论
n

基因工程的目的和基本手段:
选用合适的载体把供体DNA(外源基因)运 载到相应的受体细胞内,从而复制、扩增出 大量的目的DNA分子或者转录、表达为相应 产物,所有这些都必须选择合适的载体。

n

载体( Vector ):
能够通过基因重组技术携带、运载外源基 因或者DNA片段到达受体细胞,完成克隆、 复制、表达的具有特定结构和功能的DNA分 子运载工具。
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基因工程中所使用的载体可分类:
n

克隆载体(cloning vector):
克隆载体是指可以携带外源基因或DNA片段进入受体 细胞并使外源DNA大量扩增的复制单元,适用于复制扩 增外源DNA。

n

转录载体(transcription vector):
转录载体是以DNA为模板、用RNA聚合酶Ⅱ合成RNA的 过程,多采用体外转录体系。

n

表达载体(expression vector):
表达载体是用于表达原核或真核细胞中某个特定基 因所编码的蛋白质产物的载体,其克隆位点的上游含有 强启动子、下游含有转录终止序列,适用于表达某特定 蛋白质。

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载体 vector
n

克隆、表达的基本流程是:
克隆载体 转录载体

DNA

DNA

RNA
表达载体

蛋白质

原核载体: 质粒(pBR322,pUC)噬菌体(λ,M13) 真核载体:酵母、病毒载体等

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二、克隆载体
目前使用的载体,按其特性可分为六类: ① 质粒(plasmid); ② 噬菌体(bacterphage); ③ 黏性质粒(cosmid); ④ M13噬菌体(phage Ml3); ⑤ 酵母(yeast)载体; ⑥ 真核细胞病毒载体(eukaryotic virus vector)。 前四类克隆载体用于原核细胞中; 酵母和病毒载体则属于真核细胞克隆或 表达载体。
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(一)基因工程中的克隆载体应具有特性
① 具有复制子,在宿主细胞内可自主地复制, 并携带重组DNA分子一同扩增;可转移性。 ② 有单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点 (multiple cloning site,MCS),MCS是人工合成 的一段含有多个不同的单一限制性内切酶切点的 DNA序列,它有利于外源基因插入该区域; ③ 有选择性遗传标记,如抗药基因、酶基因、 营养缺陷体及噬菌斑形成能力等,便于筛选 出阳性重组体; ④ 拷贝数高(10—200个/每个细胞),易于分离; ⑤ 生物安全性好。
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(二)常用的克隆载体
1. 质粒(plasmid)
存在于细菌染色体外,具有自主复制功能的 小环状双链DNA分子。 Plasmid chromosome

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态, 但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染 色体地复制而复制。
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n

(1) 基因载体应具备的必要条件: 1)有多种限制性内切酶切点,多克隆 位点MCS,但每种切口最好只有1个; 2)有筛选选择标记,如抗药性标记, β-半乳糖苷酶基因(lac Z)蓝白斑试验; 3)有一定容量; 4)拷贝数多,每个宿主菌能容纳的最多数。

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(2)普通型载体 pBR322的结构图
HindIII BamHI PstI SalI ScaI Amp
r

pBR322
(4.36 kb)

ori

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Eco RⅠ Hind Ⅲ
电泳 重组DNAAmprTcs提取DNA 无菌落阳性菌落筛选重组子 Tcr Amp Tc r 2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA 转化 AmprTcs rAmprTcr

氨苄青霉素 抗性基因

Bam HⅠ Sal Ⅰ

r (amp )

Pst Ⅰ

pBR322

四环素(ter ) r 抗性基因

Ava Ⅰ

Ori
Pvu Ⅱ
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Amp

Tet 插入片段

pBR322

Tet平板

Amp平板

抗药性标志的选择
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标记基因按用途分为
1. 选择标记基因: 用于鉴别目标载体DNA, 把成功转入载体/重 组体的受体菌选出来,如抗生素抗性基因 (氨苄、四环、卡那、氯霉等) 2. 筛选标记基因: 用于区别重组质粒和载体质粒(非重组质 粒),把重组体的特殊表型挑选出来。如α互补、插入失活。

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(3)pUC质粒系列
pUC质粒系列也是 HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI 在pBR322基础上改建成 的。 EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII 它含有pBR322的大 pUC19 部分,包括完整的ampr 基因和复制起始点。去 LacZ 除了pBR322的tetr区 段,换用了M13噬菌体 的476bp片段,含LacZ Apr 不得基因及其启动子的 (2.68kb) 操纵基因、M13的多聚 接头polylinker. Ori
pUC18
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三个显著特点:
(1)分子量更小,仅2.7KB,容纳外源DNA量增 大;有高的拷贝数(每个细胞含500-700个拷贝)。 (2)含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因 LacZα,可利用α-互补原理进行蓝白筛选。 (3)多克隆位点区(MCS)由人工合成的多个单一 酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相 同,可使pUC上克隆的目的基因直接转移到 M13mp载 体,进行DNA测序和体外突变等研究。
* 476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5’-序列,表达半乳 糖苷酶的α片段。 * Lac Z 上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 * lac Z 之内是M13的多功能连接器。

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(4)多功能质粒载体
综合以上特点,质粒载体结构+单链噬菌体复制和 包装信号。如pBluescriptIIKS(+/-)

(5)穿梭质粒
质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以 构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质 粒,并在真核细胞中表达,因此这类载体在基因工 程中应用广泛。

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2. 噬菌体 (Phage)
噬菌体是比细菌还 小得多的微生物,和病 毒侵犯真核细胞一样, 噬菌体侵犯细菌,也可 以认为它是细菌里的 “寄生虫”。它本身是一 种核蛋白,核心是一段 DNA , 结构上有一个蛋 白质外壳和尾巴,尾巴 上的微丝可以把噬菌体 的DNA注入细菌内。
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* λ噬菌体(λphage) 基因组分三个区域:左侧区、中间区(非必 需区)、右侧区DNA,替换型载体,外源 DNA9-23kb常用:EMBL 系列、 λgt 系列、 charon系列 * 粘性质粒(cosmid): λDNA的 cos区+质粒,双链环状DNA,克隆容 量:40-50kb * M13噬菌体 最大优点:产生单链DNA

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λCIts857
λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。 诱导的因素可能很多,实验室常用的是热诱导: 分离得到某些 λ 噬菌体,在低温时 ( 30℃ ) 建立 溶原,用高温(420C)则出现裂解。 λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的,称为c1ts。 λcl ts1857,可作为组件插入质粒DNA内。目的 基 因 插 在 λcl ts857 下 游 , 重 组 体 的 目 的 基 因 在 42℃ 表 达 , 30℃ 不 表 达 。 这 种 方 法 称 为 热 诱 导 表 达,使用的是温敏开关。
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30℃下培养:

阻遏 蛋白

ori

PL

目的基因

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42℃下培养:

阻遏 蛋白

失活
目的基因

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3.
酵母是单细胞真核生物,可接受质粒转化。 酵母质粒有 Yip(integrate)整合型, Yep(epi-some)附加体型, Yrp(replication)复制型。

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酵母人工染色体载体
(Yeast artificial chromosome vector, YAC )

把酵母染色体与基因复制和表达有关 的主要组件都组装在质粒上,令质粒行使 酵母的转录功能和复制功能。 pYAC只以单抄本方式繁殖,所以不适 用于以生产为目的的基因工程。 主要用 于人类基因组研究和巨大基因如人类DMD 基因达Mbp(106bp)数量级基因的克隆。

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4.其他大容量克隆载体
n

噬菌体人工染色体 PAC 载体 ( Phage P1 artificial chromosom vector) n 细菌人工染色体 BAC 载体 (Bacterial artificial chromosom vector ) n 哺乳动物人工染色体 MAC 载体 (Mammal artificial chromosom vector ) n 人类人工染色体 HAC 载体 (Human artificial chromosom vector ) 主要用于人类基因组计划和模式生物基因组测序

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三、表达载体
(expressing vector) 定义:
能在受体细胞中表达(转录和翻译)外源基因 的载体。 这类载体除具有克隆载体所具备的性质以 外,还带有表达构件——转录和翻译所必需的 DNA序列。一般要求一个强的启动子、两侧的调 控序列和转录终止信号rrnB。
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Gene

Gene expression system

Gene vector system

Gene delivery system

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表达载体多种多样,
受体细胞不同表达载体不同,如大肠 杆菌、分枝杆菌、放线菌、酵母、哺乳动 物细胞等,各有相应的表达载体。 大肠杆菌质粒表达载体和哺乳动物细 胞的质粒表达载体最为常用,以其为例, 理解原核、真核表达载体的各自特点。
1. 原核基因工程表达载体 2. 真核基因工程表达载体
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高效表达质粒
组成特点: * 强启动子, * 保证正确阅读AUG的序列ATGNATGNATG, * rrnB 强终止序列, * 多克隆位点 MCS。

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(一)大肠杆菌表达载体
1.大肠杆菌表达载体的构成

*大肠杆菌表达载体中含有:
复制位点、抗性基因、克隆位点,可以 导人大肠杆菌,这些特点与克隆载体一 样。

* 表达载体中含有表达系统元件即:
启动子 一 核糖体结合位点 一 克隆位 点 一 转录终止信号。
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多克隆位点
polylinker

复制起始点

ori

Amp Amp

遗传标记

基因载体
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2.大肠杆菌表达载体的重要元件 (1)启动子(promoter) 大肠杆菌表达载体中常用的启动 子有:trp-lac启动子、λ噬菌体PL 启动子和T7噬菌体启动子。

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trp-lac启动子,亦称tac启动子。 是一个双启动子,或称杂合启动子。 tac 启动子是一组由lac和trp启动子人 工构建的杂合启动子。由trp启动子加上lac 操纵子中的操纵基因、SD顺序融合而成。 整个tac启动子受lac阻抑物调控,在 lac阻抑物高水平表达的lacl大肠杆菌菌株 中,其转录可被抑制,加入异丙基硫代半乳 糖苷(1PTG)可诱导其表达。 常用的受体菌株有RB791、XL-I-blue、 SB221、JM109等。
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λ噬菌体PL启动子:
启动子受控于温度敏感的阻抑物(clts 857)。 clts 857在低温下(37℃)可以阻抑PL 启动 子的转录,但在高温下(42℃) 则失去阻抑作 用。因此,PL是一种温度诱导的启动子。 大肠杆菌M5219株含有λ噬菌体的缺陷型原 噬菌体,可以编码 clts 857。含PL启动子的表达 载体需转化到M5219菌株中才能调控表达。常采 用30℃扩增,40℃诱导以减少热休克蛋白的产 生。有些热休克基因可编码蛋白酶,降解产物。
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T7 噬菌体启动子:

是一个表达效率很高的启动子, 但需要特殊的受体菌。现在已有 JM109(DE3)等,是溶原菌,带有 lac UV5启动子控制下的 T7噬菌体RNA聚 合酶基因,可用IPTG诱导。

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(2)核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译效率严格依赖于是 否有核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS )的存在,因此,RBS是大肠杆 菌表达载体中必不可少的元件。 核糖体结合位点包括起始密码子(ATG) 和SD序列。 但也有人将所构建的载体中的SD序列称 为RBS位点,或RBS序列。

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(3)转录终止序列
目前常用的各种表达载体中,有些虽不 含有转录终止序列,在表达某些外源蛋白 时,也可获得较满意的效果,但对多数外 源蛋白的表达是不合适的,因而多数表达 载体中都带有转录终止序列。常用的转录 终止序列中,短的可以是几十bp,长的可 达700~800bp。

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3. 常用的大肠杆菌表达载体有
pKK 序列(tac 启动子); pGEx(tac 启动子并含 GST 融合蛋白表达系
统,易表达产物,要求后加工时去除非目 的蛋白);

pBV系统(PLPR启动子,温度诱导表达); 6Xhis 表达系统; pGEM-T系统(PCR克隆)。
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4. 常用表达载体

举例 ⑴ pBV220系统

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本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、 JM103、C600,质粒拷贝数较多,因此小 量简便快速提取即可满足需要。 本系统为温度诱导,外源基因表达量 可达细胞总蛋白的20%~30%; 产物以包含体形式存在不易降解均一性 好;

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pBV220系统国内使用最多的载体, 其组成: ① 来源于pUC8多克隆位点 ② 核糖体rrnB基因终止信号 ③ pBR322第4225~3735位 ④ pUC18第2066~680位 ⑤ λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子 ⑥ pRC23的PL启动子及SD序列

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pBV220系统优点:
① cIts857抑制子基因PL启动子同在一个 载体上,可以转化任何菌株,以便选用蛋 白酶活性较低的宿主细胞,使表达产物不 易降解。 ② SD序列紧跟多克隆位点,便于插入带起 始ATG的外源基因,可表达非融合蛋白;

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③ 强的转录终止信号可防止出现“通 读”现象,有利于质粒-宿主系统的稳 定; ④ 整个质粒仅为3.66kb,有利于增加 其拷贝数及容量,可以插入大片段外 源基因; ⑤ PR和PL启动子串联,可以增强启动 作用;

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( 2)融合表达质粒pBG-2的结构

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pBG-2是由pBV220系统衍生的便于 产物纯化的融合表达载体。 该质粒在PRPL启动子下游插入 protein G的 IgG Fc 结合区基因片 段180个碱基对,下游是多克隆位 点,引入剪切融合蛋白具有与 IgG 结合的活性,可用亲和层析简化下游 工艺。

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(3)表达GST融合蛋白的表达载体 n 谷胱甘肽转移酶基因插在tac启动子和 MCS之间,外源基因插入后,表达出融合 蛋白,具有酶活性。

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(二) 哺乳动物表达载体
克隆基因要在哺乳动物细胞中进行表 达,必须先将基因重组到适当的真核表达 载体中。 1. 真核表达载体构成 哺乳动物细胞表达载体是从克隆载体上 发展起来的,如穿梭质粒,要在细菌中增 殖,含有必不可少的原核序列:在大肠杆 菌中能起作用的复制起始位点、便于筛选 重组质粒的抗生素抗性基因。
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2. 真核表达载体表达元件 但在质粒中还包括在真核细胞中的药物抗 性基因和真核表达组件,有的还带有在真核 细胞复制的元件(真核复制起始位点)。 真核表达载体中含有一套真核表达元件: 启动子/增强子—克隆位点—终止信号和 加 poly(A) 信号。

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n

原核启动子在哺乳动物细胞中是不 起作用的。 真核表达载体必须有真核启动子和 增强子。 各种启动子和增强子在不同类型的 细胞中活性相差很大,有个选择过程。 细胞源的启动子,增强子元件,如 热休克蛋白,肌动蛋白启动子。

n

n

n

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n

病毒来源的启动子和增强子, 宿主范围较广,在多种细胞中都可有一 定的活性。 如SV40病毒早期基因启动子(SV40)、 Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复顺序 (RSV)、人类巨细胞病毒(CMV)等。这些增 强子/启动子组合可在广泛的宿主细胞中 作用,是目前真核表达载体中常用的。

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3.转录终止和加 poly(A) 真核基因表达的过程中,RNA聚合酶Ⅱ 通常跨过poly(A)位点继续进行转录,成 熟的mRNA 3′端是经过转录后切割并加 上poly (A)而形成的。 准确而有效地加上 poly (A),有赖于 mRNA中不同的序列,一是位于poly(A)位 点下游的GU富集区或U富集区,二是 poly(A) 加尾信号:AAUAAA。
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真核表达载体必须带有poly(A)位点下游 序列,以保证新转录的mRNA能够有效地加上 poly(A)。 尽管全长cDNA克隆可能已带有AATAAA 序列和一段 poly(A),但这些内源性序列本 身并不足以保证poly(A)的形成。 因此,载体中务必包含切割和加poly(A) 所必不可少的下游GU富集区。
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最为常用的加 poly(A)信号来 自SV40,是一段237bp的BamH I— Bcl I限制酶切片段,其中同时含有 早期和晚期转录单位的切割与加 poly(A)信号。两套信号作用的方向 相反,并分别位于不同的DNA链上, 对mRNA加工很有效。
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4.常用的哺乳动物细胞表达载体
pcDNA3 含有来自CMV的启动子和增 强子,含有显性药物抗性基因 neor, 其产物可使G 418 抗生素磷酸化而灭 活,使细胞具有 neor。此外还含有转 录终止信号、多聚腺苷酸化信号。

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5.病毒表达载体
常用在真核细胞工程中,包括痘病 毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、HSV等 DNA病毒为多见。RNA病毒中以反转录病 毒载体常用。 也有用蚕多角体杆状病毒载体的。 病毒表达载体除用以表达目的基 因,制备疫苗外,目前也用于基因治 疗。

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基因载体系统

病毒载体系统

非病毒载体系统

DNA-

DNA-

DNA-

DNA/RNA

反 转 录 病 毒 载 体

腺 病 毒 载 体

腺 伴 随 病 毒 载 体

单 纯 疱 疹 病 毒 载 体

慢 病 毒 载 体



DNA

阳 离 子 脂 质 复 合 物

蛋 白 质 复 合 物

阳 离 子 多 聚 物

嵌 合 物

细胞内包装
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细胞外包装

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病毒载体概述(1) 要求:1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒
2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病

容量:自身基因组大小的105%~110% 类型:1、重组型病毒载体
2、无病毒基因的病毒载体 可复制型 复制缺陷型 复制缺陷型

组成:1、病毒复制和包装元件
2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜

用途:基因转移和表达
1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究
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病毒载体概述(2)

优点:1、利用病毒天然的感染性进入细胞,转导效率高;
2、复杂的装配过程由细胞完成; 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。 存在的问题:1、安全性
2、靶向性 3、有效性
细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性

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常用的病毒载体的特点
病 毒载 体 反 转录 病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb 腺 病毒 载体 双链 DNA 病毒 36k b 生 物学 特性 可 整 表 有 可 不 外 表 免 可 整 无 可 在 网 具 递 可 容 可 感染 分裂细 胞; 合到 染色体 中; 达时 间较长 ; 致癌 的危险 ; 感染 分裂和 非分 裂细胞 ; 整合 到染色 体中 ; 源基 因表达 水平 高; 达时 间较短 ; 疫原 性强; 感染 分裂和 非分 裂细胞 ; 合到 染色体 中; 致病 性;免 疫原 性弱; 长期 表达外 源基 因; 骨 骼 肌 、 心 肌 、 肝 脏 、 视 膜等 组织中 表达 较高; 有 嗜 神 经 性 ; 可 逆 轴 突 传 ; 潜伏 感染; 量大 ; 感染 分裂和 非分 裂细胞 ; 适用 范围 E x v iv o 基 因 治 疗 ; 肿瘤 基因治疗。

I n v iv o 基 因 治 疗 ; 肿瘤 基因治疗; 疫苗 。

A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb

I n v iv o 基 因 治 疗; E x v iv o 基 因 治 疗 ; 遗传 病基因治疗 ; 获 得 性 慢 性 疾 病 的 基因 治疗 。 神 经 系 统 疾 病 的 基 因治 疗; 肿瘤 的基因治疗 。

H SV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152k b

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病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体

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无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因,只保留其复制

和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生 型病毒的外壳/外膜和感染性,但不表达病毒蛋白。
腺伴随病毒载体:
ITR

gene

ITR

反转录病毒载体:
ψ LTR

pA

gene

LTR

腺病毒载体:
ITR

gene

ITR

pA

单纯疱疹病毒载体:
pac gene ori gene gene gene gene

共 113 页 第 64 页

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n

真核细胞工程常用病毒作表达载体,如 反转录病毒。 反转录病毒是一类含RNA的病毒,进入 受体细胞后,RNA逆转录成DNA,通过两 端由数百bp组成的长末端重复序列 (LTR),整合到染色体DNA上,成为原 病毒(前病毒)。

n

共 113 页 第 65 页

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构建反转录病毒载体的途径(一) 1)获取前病毒DNA,
从感染的细胞中分离整合的前病毒DNA,

2)构建重组穿梭质粒,
根据不同要求进行改造前病毒DNA:①去除病毒结构基 因和酶基因;②组装入目的基因、选择标记基因;③保 留LTR、启动子及包装信号等元件,与大肠杆菌源的质 粒重组。这样的载体可转化大肠杆菌并增殖。

3)获得重组病毒RNA,
重组质粒DNA转化受体细胞,受体细胞内不含有病毒的 蛋白结构基因。虽可转录出含有目的基因重组病毒 RNA,因其缺失包装所需的某些蛋白质的基因,故没有 子代病毒体产生。
共 113 页 第 66 页

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4)制备包装细胞
把反转录病毒包装必需的全部蛋白质的基因先整合到受体细 胞基因组,构建好包装细胞。此细胞无病毒的核酸和包装信 号,也不产生病毒颗粒,只有病毒的一些蛋白质。

5)转化包装细胞,
提取重组病毒RNA,直接转化包装细胞,可产生有效的反转 录病毒颗粒(伪病毒)。

6) 用反转录病毒颗粒(伪病毒颗粒)感染人 体细胞。但不会再产生子代病毒,故是安全的。实现了目的
基因的转移,达到预期目的。

此系统称为不需辅助病毒但需要包装细胞的 重组反转录病毒质粒载体系统。

共 113 页 第 67 页

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病毒载体包装系统 组成: 1、宿主细胞 2、辅助元件(辅助质粒、辅助病毒) 3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件
gag pol env gag pol env
ψ LTR LTR

包装细胞只产蛋白 不产病毒颗粒

ψ LTR LTR

病毒RNA 重组质粒

重组病毒 伪病毒

改造 前病毒DNA

转化细胞只产RNA 不产病毒颗粒

图1 反转录病毒包装系统示意图
共 113 页 第 68 页

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构建反转录病毒载体的途径(二) 1.获得重组病毒RNA(方法同前) 2.辅助病毒的构建,病毒结构蛋白质须由另一辅助病
毒提供,辅助病毒只含病毒的结构蛋白基因,没有调 控基因、复制和致病的有关序列。

3.共同转染细胞,通过互补,获得重组反转录病毒
此系统称为辅助病毒互补重组反转录病毒质粒载 体系统。

共 113 页 第 69 页

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Helper virus +helper plasmid

Host cell +vector DNA

Recombinant helper virus

proviral cell

helper virus
共 113 页 第 70 页

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基因表达中的目些问题

共 113 页 第 71 页

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基因工程的表达体系 操纵子理论在基因工程中的应用 目的基因翻译表达及其准确性 常用基因载体

共 113 页 第 72 页

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共 113 页 第 73 页

2008-1-28 15:21:27 PM

载体— —
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA YAC(酵 母人工染 色体) ampr

EcoR I

自我复制 克隆位点 选择标志

terr pBR322

ori

共 113 页 第 74 页

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基因载体是一类能自我复制的DNA分子,其中的 一段DNA被切除而不影响其复制,可用以置换或插 入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。 常用的载体有质粒、噬菌体、病毒

共 113 页 第 75 页

2008-1-28 15:21:28 PM

原核生物表达体系: 大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌

共 113 页 第 76 页

2008-1-28 15:21:28 PM

大肠杆菌表达体系的优点: 积累了充足经验,有数不清的载体可供应用; 可因不同载体而选择不同菌种作宿主; 操作安全,致病能力低 ; 成本相对低得多 ; 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆,称为 亚克隆(subclone),然后采用其它方式转移至真 核细胞上表达。

共 113 页 第 77 页

2008-1-28 15:21:29 PM

缺点: 原核生物载体构建的重组体是无法进入 动物细胞进行表达; 没有加工所需的酶系统; 热源、内毒素不易除去 ; 常会形成包涵体。
共 113 页 第 78 页

2008-1-28 15:21:29 PM

表达体系的发展
表达体 第二代 酵母表达体系 第四代 基因直接导入 载体 穿梭质粒 DNA本身 宿主 细菌 酵母 生殖细胞、 体细胞、个体

第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体

第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞

共 113 页 第 79 页

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基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨 认、结合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻 译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理 论知识,应用已知的调控序列进行重组、改造。

共 113 页 第 80 页

2008-1-28 15:21:30 PM

共 113 页 第 81 页

2008-1-28 15:21:30 PM

一、启动子与转录调控 原核生物的转录单位是操纵子,操纵子包括 相关结构基因及其上游的调控序列。
调控序列 结构基因

共 113 页 第 82 页

2008-1-28 15:21:30 PM

以乳糖操纵子(lac operon)为例: 操纵子
I
CAP P O

Z

调控区 P:启动序列 O:操纵序列

Y 结构基因

X

I:调节序列

共 113 页 第 83 页

2008-1-28 15:21:31 PM

I

CAP

P

O

Z

Y

X

诱导物

I

CAP

P

O

Z

Y

X

共 113 页 第 84 页

2008-1-28 15:21:31 PM

二、强启动子的构建

共 113 页 第 85 页

2008-1-28 15:21:32 PM

RNA聚合酶保护区 结构基因
5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′

-50

-40

-30

-20

-10

1

10

-35 区 TTGACA AACTGT RNA-pol辨认位点 (recognition site)

开始转录 -10 区 T A T A A T Pu A T A T T A Py (Pribnow box)

原核生物启动子保守序列
共 113 页 第 86 页

2008-1-28 15:21:32 PM

-35区 trp
tRNATyr TTGACA TTTACA TTTACA TTGATA CTGACG TTGACA N17 N16 N17 N16 N16

-10区
TTAACT TATGAT TATGTT TATAAT TACTGT TATAAT N7 N7 N6 N7 N6

RNA转录起始 A A A A A

lac recA
Ara BAD

共有序列

共 113 页 第 87 页

2008-1-28 15:21:32 PM

顺式作用元件 结构基因
-GCGC---CAAT---TATA

转录起始 增强子

TATA盒 CAAT盒 GC盒

真核生物启动子保守序列
共 113 页 第 88 页

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RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合

共 113 页 第 89 页

2008-1-28 15:21:33 PM

Ptac启动子
Ptrp与 Plac的杂化产物 Ptac比原来各自的活性强 -35区 -10区 TTAACT TATAAT TATAAT

Ptrp
共有序列

TTGACA TTGACA TTGACA

Ptac17

共 113 页 第 90 页

ATG I II III

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TAA V
转录终止区

IV
成熟蛋白质 CS

转录起始 翻译起始 信号肽

I II III
CS--cloning site

I
CS

V

I

II ATG
CS

V

I

II

III

V

Ori

共 113 页 第 91 页

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三、蓝白斑试验(IPTG-Xgal 试验) 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷 (IPTG) 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物

共 113 页 第 92 页

2008-1-28 15:21:34 PM

P

O

Z

Y

X

诱导物

乳糖
P O

Z

Y

X

共 113 页 第 93 页

2008-1-28 15:21:35 PM

Am

lacZ

N2H

COOH

α片段

ω片段
lacZ

标志补救(?-半乳糖苷酶法)
共 113 页 第 94 页

2008-1-28 15:21:35 PM

Lac Z

X-gal

蓝色化合物

X-gal
共 113 页 第 95 页

2008-1-28 15:21:35 PM

(LacZ基因 N端序列) LacZ基因 N端序列

插入片段 (LacZ基因失 活)

LacZ酶

共 113 页 第 96 页

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四、转录终止结构的插入 转录终止:非依赖ρ因子的转录终止需要茎环 结构,以t(termination)代表。
U A A C C G C C G 5’…AUACCA U

G A G C G G C UUUUUUUUU…3’

共 113 页 第 97 页

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RNA-pol
5′ 3′ 3′ 5′

5?pppG

茎环结构使转录终止的机理 ? 使RNA聚合酶变构,转录停顿; ? 使转录复合物趋于解离,RNA产物释放。
共 113 页 第 98 页

2008-1-28 15:21:36 PM

五、增强子
转录起始前-30区为TATA盒,还有多种顺式作用 组件相互配搭成启动子。 增强子 远距离地、不同方向地控制启动子的活 性。增强子的核心序列是TGTGGAATTAG。 增强子的作用特点有:非特异性远距离操纵、 多方向性。
酵母结构基因的上游还有上游活化序列(upstream activation sequence,UAS)。
共 113 页 第 99 页

2008-1-28 15:21:36 PM

共 113 页 第 100 页

2008-1-28 15:21:37 PM

核糖体结合位点(S-D序列)
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno),又称为核糖体结合点。

3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA

AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位
共 113 页 第 101 页

2008-1-28 15:21:37 PM

30S

lF1、3 mRNA met-GTP-lF2

50S

fmet

GTP lF2, GDP+Pi

lF1、3

30S 50S fmet
共 113 页 第 102 页

2008-1-28 15:21:37 PM

共 113 页 第 103 页

2008-1-28 15:21:37 PM

基因克隆时的定向插入

插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会 倒装,保证了在其下游目的基因插入后,沿5’→3’ 方向正确转录,这种构建方式称为定向插入。

共 113 页 第 104 页

2008-1-28 15:21:37 PM

EcoRI

HindIII

LacZ

pUC19

Ori复制起 点 APR

共 113 页 第 105 页

2008-1-28 15:21:38 PM

能正确读出三联体密码的起始序列
如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切 点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未 清楚,可在目的基因之前设保险序列:

5’…ATGNATGNATG 5’…ATGNATGN ATG 123 456 5’…ATGN ATG NAT GXY 123 456 5’…ATG NAT GNA TGZ 123 456

共 113 页 第 106 页

2008-1-28 15:21:38 PM

ATG I II III IV
成熟蛋白质 CS

TAA V
转录终止区

转录起始 翻译起始 信号肽

I II III
CS--cloning site

I
CS

V

I

II ATG
CS

V

I

II

III

V

Ori

共 113 页 第 107 页

2008-1-28 15:21:39 PM

共 113 页 第 108 页

2008-1-28 15:21:39 PM

核糖体结合位点(S-D序列)
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno),又称为核糖体结合点。

3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA

AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位
共 113 页 第 109 页

2008-1-28 15:21:39 PM

30S

lF1、3 mRNA met-GTP-lF2

50S

fmet

GTP lF2, GDP+Pi

lF1、3

30S 50S fmet
共 113 页 第 110 页

2008-1-28 15:21:39 PM

共 113 页 第 111 页

2008-1-28 15:21:39 PM

基因克隆时的定向插入

插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会 倒装,保证了在其下游目的基因插入后,沿5’→3’ 方向正确转录,这种构建方式称为定向插入。

共 113 页 第 112 页

2008-1-28 15:21:39 PM

EcoRI

HindIII

LacZ

pUC19

Ori复制起 点 APR

共 113 页 第 113 页


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