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3 分子发光分析法_图文

3 分子发光分析法_图文

第三章 分子发光分析法
Molecular Luminescence Analysis

本章主要内容
第一节 荧光和磷光的产生 第二节 荧光分析方法 第三节 化学发光分析
2

第一节 荧光和磷光的产生
一、生活中的分子发光现象

荧光灯

荧光棒

荧光笔

萤火虫

3

二、分子发光的概念

? 室温下,大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的 分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定,将很快回 到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射,这种现象称为 分子发光。

激发态

吸收能量

光辐射

基态
4

? 分子发光可根据分子受激时所吸收能量来源的不同分为以下 几类:
? 光致发光: 以光源来激发而发光(荧光灯, 荧光笔) ? 电致发光: 以电能来激发而发光(发光二极管) ? 生物发光: 以生物体释放的能量激发而发光(萤火虫) ? 化学发光: 以化学反应能激发而发光(荧光棒)
5

三、 分子发光的过程(以光致发光为例)

? 基态分子受到光照激发后,跃迁到激发态,随后放出能量回 到基态。如果能量是以光的形式释放,则会发射出荧光或磷 光。在光照激发和退激发光的过程中:

? (1)分子中电子的能级发生了变化。 ? (2)分子中电子的自旋状态发生了变化。

分子中的价电子( ?、n电子) 处于不同的自旋状态,通常 用电子自旋状态的多重性来 描述。

单个电子的两种不同自旋状态 6

1. 分子中电子自旋状态的多重性
? 大多数分子含有偶数电子,基态分子每一个轨道中两个电子自 旋方向总是相反的?? ,处于基态单重态(Singlet state),用 “S0”表示 ;
? 当物质受光照射时,基态分子吸收光能产生电子能级跃迁,由 基态跃迁至更高的单重态,电子自旋方向没有改变,净自旋 = 0 。这种跃迁产生的概率大。

π*轨道 n轨道

处于单重态的分子, 电子自旋方向相反

π轨道

S0, S1, S2, S3分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态

基态单重态 S0

第一激发单重态 S1

7

? 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变,由基态单 重态→激发三重态(Triplet state),净自旋 ? 0。这种跃迁产 生的概率小。

π*轨道 n轨道

处于三重态的分子, 电子自旋方向相同

π轨道

T1、T2、T3分别表示第

一、二、三激发三重态

基态单重态 S0

第一激发三重态 T1

8

2 激发态分子的去活化
? 处于激发态的分子,通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式 再回到基态,其中以速度最快,激发态寿命最短的途径占优 势。
? 辐射跃迁指以光的形式辐射多余的能量,包括荧光和磷光。 ? 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量,包括振动
弛豫、内转换、外转换和系间跨越等。
9

荧光和磷光体系能级图

S2
V=3 V=2 V=1 V=0

内转换 S1

振动弛豫

hv

T1
振动弛豫

系间跨越

振动弛豫
hv

V=3

S0

V=2 V=1

V=0

吸光?1

吸光?2 荧光?3 磷光?4

10

(1)无辐射跃迁去活化过程

? ①振动弛豫
? 在同一电子能级中,电子由高振动能级跃迁至低振动能级, 而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为 10-12s数量级。

S2

S1

T1

振动弛豫

振动弛豫

S0

振动弛豫

11

? ②内转换 ? 指相同多重态间的无辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以
至其振动能级有重叠时,常发生电子由高能级以无辐射跃迁 方式转移至低能级。内转换过程在10-13~10-11s之间。

S2

S1

T1

内转换

S0

12

? ③系间跨越
? 指不同多重态间的无辐射跃迁,它涉及受激电子自旋状态的 改变,例如,S1→T1,使原来两个自旋配对的电子不再配对。 一般情况下难以发生,但如果两个电子能级的振动能级有较 大的重叠时,则可以通过系间跨越在不同多重态间进行转移。

S2

S1

T1

系间跨越

S0

13

④外转换 ? 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转
移,使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。
14

(2) 辐射跃迁去活化过程

? ①荧光发射

? 处于激发态的分子放出热能先回到第一激发单重态的最低振 动能级,然后在10-9~10-7s内发射一个光子并返回基态的过 程。

S2

内转换 S1

T1

振动弛豫

S0

吸光?1

吸光?2 荧光?3

15

? ②磷光发射

? 某些单重和三重激发态能级有较大重叠的分子,以放热的 形式,经系间跨越达到三重激发态,再经振动弛豫到达三

重态的最低振动能级,然后在10-4~10s内跃迁回基态并 发射磷光。

S2 内转换 S1

T1

振动弛豫

系间跨越

振动弛豫

S0

吸光?1

吸光?2 荧光?3 磷光?4

16

? 荧光和磷光的根本区别是:
? 荧光是由激发单重态最低振动能级至基态的跃迁产 生的;
? 磷光是由激发三重态最低振动能级至基态的跃迁产 生的。
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荧光和磷光测定注意事项:

消除猝灭剂

避免 荧光猝灭
低浓度 荧光物质溶液

低温
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3 激发光谱和发射光谱
? 激发光谱
? 固定荧(磷)光的发射波长(一般在最大发射波长处),改 变激发光波长,测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标, 荧(磷)光强度为纵坐标作图,即可得到荧(磷)光化合物 的激发光谱。
? 发射光谱
? 简称荧(磷)光光谱,固定激发光波长和强度,在不同波长 下测定所发射的荧(磷)光强度,以波长为横坐标,以荧 (磷)光强度为纵坐标,即可得到荧(磷)光光谱。
19

激发光谱 荧光光谱 磷光光谱
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
20

荧光发射光谱与吸收光谱的镜像关系

荧光强度

0→0

吸光

0→1 0→2

荧光
1←0 2←0

0→3

3←0

S1
吸光

250 300 350 400 450

蒽的乙醇溶液的吸收光谱(左)和

荧光光谱(右)

S0

4 3 2 1 V=0
荧光
4 3 2 1 V=0
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? 荧光发射光谱和它的吸收光谱之间呈镜像对称的原因是: ? 吸收光谱是物质分子由基态(一般处于最低振动能级)激发
至第一电子激发态的各振动能级所致,其形状决定于第一电 子激发态中各振动能级的分布情况。 ? 荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回 到基态的不同振动能级所致,所以荧光光谱的形状决定于基 态中各振动能级的分布情况。 ? 因为基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的 分布情况类似,因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。
22

小结
1 分子发光的概念和类型 2 荧光和磷光的产生过程 3 激发光谱和发射光谱
23

思考题
1 分子荧光和磷光的产生有何异同? 2 如何避免荧光猝灭现象的发生?
24

第二节 荧光分析方法

? 分子产生荧光必须具备两个条件:
? 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构,才能吸 收激发光;(一般来说,分子中必须具有大的共轭?键结构)
? 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后,必须具有一定 的荧光量子产率。

量子产率? ?

发射的光量子数 吸收的光量子数

25

一、物质结构对荧光光谱的影响
1 共轭效应
? 分子结构中具有共轭?电子的物质,体系中?电子的共轭程度 越大,则产生的荧光越强,且光谱产生红移。

化合物

量子产率 φF

λex(nm) λem(nm)



0.11

205

278



0.29

286

321



0.46

365

400

丁省

0.60

390

480

戊省

0.52

580

640

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2 刚性平面结构
? 实验发现,多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的 荧光。因为这种结构可以减少分子的振动,使分子与溶剂 或其它溶质分子的相互作用减少,也就减少了碰撞去活的 可能性。
27

3 取代基效应
? 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度 和荧光光谱有很大的影响。
? 给电子基团,如-OH、-OR、-CN、-NH2 、-NR2等,使荧 光增强。因为产生了p- ?共轭作用,增强了电子共轭程度, 使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
? 吸电子基团,如-COOH、-NO、-C=O、卤素等,会减弱甚 至会猝灭荧光。
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二、溶液的荧光强度
(一)荧光强度和溶液浓度的关系
If=Kc
? 上式中,If为荧光强度,K为常数,c为溶液浓度。
? 这种线性关系只有在极稀的溶液中,即?lc≤0.05时,才成立。
? 进行荧光测定时,和紫外可见吸收光谱一样,应用标准曲线 法定量。
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(二)影响溶液荧光强度的因素
1 溶剂对荧光强度的影响
(1)溶剂极性的影响 ? 在有些情况下,当溶剂极性增大时,荧光增强,荧光峰红移。
8-巯基喹啉在不同极性溶剂中的荧光发射情况如下

溶剂

介电常数 荧光发射峰 荧光量子产率

λ/nm

φF

四氯化碳

2.24

390

0.002

氯仿

5.2

398

0.041

丙酮

21.5

405

乙腈

38.8

410

0.055

0.064

30

(2)形成氢键或电离 ? 使荧光发射波长和强度改变。 ? 例如VB6在二恶烷中,荧光发射波长335nm ? 在水中(电离),荧光发射波长400nm(电离)
(3)溶剂对激发光或荧光有吸收 ? 如苯、丙酮、酚等在紫外区有吸收,不能作为溶剂
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2 温度对荧光强度的影响
? 温度上升使荧光强度下降。
? 主要有如下原因:
? (1)随着溶液温度的升高,介 质粘度降低,分子运动速率也 变大,从而使荧光分子与溶剂 分子或其它分子的碰撞几率增 加,外部能量转换速率变大。 因此,荧光量子产率降低。

-196℃
温 度 降 低
24℃
32

? (2)分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能 时,有可能使激发能转换为基态的振动能量,随后迅速振动 弛豫而丧失振动能量。

能量

电子与原子核间的距离

当激发态分子接受到额外 热能而沿激发位能曲线AC 移动至交点C时,有可能转 换至基态的位能曲线NC, 使激发能转化为基态的振 动能,随后通过振动弛豫 而丧失振动能量。
33

3 溶液pH值对荧光强度的影响
? (1)影响分子的电离程度

OH

O H O-

pH﹤9,有荧光 pH﹥13,无荧光

? (2)影响金属离子形成的发光螯合物
O

O Ga+

O Ga- O

NN

O

NN

O

pH=3~4时,络合比 Ga3+:R=1:1,有荧光

pH=6~7时,络合比 Ga3+:R=1:2,无荧光

NN
34

4 内滤光作用和自吸收现象
? 溶液中若存在能吸收激发光或荧光物质所发射荧光的物质, 就会使荧光减弱,这种现象称为“内滤光作用”。
? 荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱 的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时,一部分荧光发射 被自身吸收,产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。

吸光

荧光

荧光强度

35
250 300 350 400 450

三、荧光分析仪
36

激发光源 在紫外-可见区范围,通常的光源是氙灯和高压汞灯。
样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成,通常用石英,形状 以正方形和长方形为宜。
单色器 光栅
检测器 由光电管和光电倍增管作检测器,并与激发光成直角。
37

四、荧光分析法的特点和应用

(一)荧光分析法的特点

优点

1. 灵敏度高

? 荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2~4个数量级,检测下 限在0.1~0.001μg·mL-1之间。
2. 选择性好

? 既可以依据激发光谱,也可以依据发射光谱鉴定某种物质。 3. 荧光法提供比较多的物理参数

? 可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、 荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。

4. 试样量少,测定方便

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缺点 ? 应用还不够广泛。 ? 这是因为: ? ①本身能发射荧光的物质相对较少,用加入某种试剂使非荧
光物质转化为荧光物质来进行分析,其数量也还不多。 ? ②此外,荧光分析的灵敏度高,测定时对环境因素较为敏感,
干扰因素较多。
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(二)荧光分析法的应用
1. 无机化合物的分析 1) 直接荧光法 主要是 金属元素+有机试剂→可发射荧光的配合物 例如: Al3+ +桑色素→桑色素和Al的配合物(可发射荧光) 荧光强度一般与待测物浓度成正比。 较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、
镁、锌、镉及某些稀土元素等。
40

2)荧光猝灭法 ? 某种金属离子M可以与某种有机物生成可发射荧光的配合物 ? M + 有机物 → [M-有机物](可发射荧光) ? 待测定的金属元素X可以取代配合物中的M,生成无荧光的
配合物 ? X + [M-有机物] → [X-有机物] (无荧光) + M ? 荧光强度一般与待测物浓度成反比。 ? 采用该法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍、
铜、钨、钼、锑、钛等。
41

3)间接荧光法 ? 间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的分析 ? [M-有机物] (无荧光) + CN- → M-CN + 有机物(有荧光)
? 2. 有机化合物的分析 ? 1)芳香族化合物具有共轭的不饱和结构,多能发射荧光,可
以直接进行荧光测定。例如蛋白质。 ? 2)对于某些不能发射荧光的分子,可以进行衍生化反应使其
结合一个荧光基团从而能够进行荧光检测和分析。例如氨基 酸分析。
42

五、荧光分析法新技术简介
1. 同步荧光光谱
? 在同时扫描激发光和发射 光波长的过程中,使激发 波长(λex)和发射波长 (λem)保持固定的波长 间隔。
43

2.40
(a)

2. 导数荧光光谱

? 对荧光光谱图求导得到的导数曲 00..0025

线。可以在谱图上显示出微小的 240

300

(b)

变化,使光谱图的分辨率得到了

很大的提高。 240

荧光光谱

-0.25
0.05
(c)

一阶导数光谱

240

290

-0.05
苯酚水溶液的B带吸收光谱(4a4 ) 及其一阶(b)、二阶(c)导数

3. 三维荧光光谱
? 描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱, 称为三维荧光光谱。
45

4. 荧光免疫检测
? 使荧光抗体与细胞表面抗原进行反应,洗涤除去游离的荧 光抗体后,于荧光显微镜下观察,在黑暗背景上可见明亮 的特异荧光。

细胞表面特异抗原

神经元免疫荧光 46

5 用于生物芯片的标记
EM EX
47

48

小结
? 通常所说的“荧光”分析,其本质是光致发光,即依靠光能 来激发分子产生荧光。
? 荧光光谱是发射光谱,因而比紫外可见吸收光谱的灵敏度要 高。
? 荧光光谱的测定过程类似于紫外可见光谱的测定过程。 ? 进行荧光测定时受到散射光影响。
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第三节 化学发光分析

一、化学发光的基本原理
? 在化学反应中,反应产物吸收反应的化学能而被激发到激发 态,当跃迁回基态时以光辐射的形式放出能量称为化学发光。
? 例如:

NO ? O3 ??? NO2? ? O2 吸收化学能,成为激发态

NO2? ? ??NO2 ?hv 发射出光子

发光强度与NO浓度成正比

50

1 化学发光的条件 ? 1)化学反应必须提供足够的激发能,激发能主要来源于反
应焓,大小在150~400 kJ·mol-1,氧化还原反应可提供与 此相当的能量。 ? 2)要有有利的化学反应历程,使化学反应的能量至少能被 一种物质所接受并生成激发态。在液相中,芳香族化合物和 羰基化合物更容易生成激发态的产物。 ? 3)激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子, 而使该分子激发,然后以辐射光子的形式回到基态。
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2 化学发光的效率

发射光子的分子数
? ? 参加反应的分子?数0.01

需要高灵敏度的光检测器

3 化学发光的强度
? 在某一时刻t,发射光的强度I与化学反应的速度成正比。 对于一级动力学反应,发光强度I与t时刻的反应物浓度成 正比。

I(t)??dC??k[A][B]
dt

? ? 化学发光效率

dC ? 分析物参加反应的速率 dt k ? 化学反应速率常数

[ A],[B] ? 分析物浓度

52

二、化学发光的类型
1 直接化学发光和间接化学发光 ? 直接化学发光

A?B?C? ?D C? ?C?hv

被测物A或B作为反应物生成 激发态产物C*,C*直接辐射 出光子。

? 间接化学发光
A? B ? C? ? D C? ? F ? F? ? E F ? ? F ? hv

被测物A或B作为反应物生成

激发态产物C*,C*不直接发

光,而是将其能量转移给F,

使F处于激发态F*,当F*跃迁

回基态时,产生发光。

53

2 气相化学发光和液相化学发光
? 气相化学发光 ? 主要有O3、NO、S的化学发光反应,可用于监测空气中的
O3、NO、 NO2 、 H2S、 SO2、CO等。
? 液相化学发光 ? 用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉
碱等。例如,利用发光物质鲁米诺,可测定痕量的H2O2以 及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。
54

三、化学发光的装置和应用 1 化学发光的装置
样品室

样品池

光检测器

高压稳压 电源

放大器

信号输出 装置
55

2 化学发光的应用
? 化学发光分析最大的特点是灵敏度高;且能够进行快速连续 分析。
? 例如,监测空气中有害物质如O3、氮氧化物、CO、SO2、 H2S等的灵敏度可达1~3 ng·cm-3。
? 鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定水中的金属离 子含量。灵敏度可达0.2 ng·cm-3。
间接测定葡萄糖
间接测定氨基酸
56

某些物质生物发光分析的检测水平

化合物
NADH NADPH 6-磷酸-葡萄糖 乙醇 睾酮 雄酮 乳酸脱氢酶 葡萄糖―6―磷酸脱氢酶 乙醇脱氢酶 已糖激酶 氨甲蝶呤 三硝基甲苯

检测水平/ 10-12 mol

0.5~1000

0.5~1000

2~100

(0.003~0.012)×10-2

0.8~1000

0.8~1000

0.001~1

0.001~1

0.001~10

0.001~1

0.5~2

10 amol (a=10-18)

57

58


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