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纸层析法分离鉴定氨基酸_图文

纸层析法分离鉴定氨基酸_图文

实验二、纸层析法分离鉴定氨基酸 实验二、 分离鉴定氨基酸
一、目的: 目的:
学习并掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的 原理和方法。 原理和方法。

二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分 配层析法,其中滤纸纤维上吸附的水是固定相 水是固定相, 配层析法,其中滤纸纤维上吸附的水是固定相, 展层用的有机溶剂是流动相 在层析时, 有机溶剂是流动相。 展层用的有机溶剂是流动相。在层析时,

将样品点在距滤纸一端约2~ 的某一处, 将样品点在距滤纸一端约 ~3cm的某一处, 的某一处 该点称为原点; 该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂 沿滤纸的一个方向进行展层, 沿滤纸的一个方向进行展层,这样混合氨基 酸在两相中不断分配。由于分配系数( 酸在两相中不断分配。由于分配系数(Kd) 不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。 不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置, 物质被分离后在纸层析图谱上的位置,可用 比移值( 来表示。 比移值(Rf)来表示。 所谓R 是指在纸层析中, 所谓 f,是指在纸层析中,从原点至氨基酸 停留点(又称为层析点)中心的距离( ) 停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与 原点至溶剂前沿的距离( )的比值。 原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值。如图

原点到层析点中心的距离 X Rf = = Y 原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下(如温度、展层剂的组成、 在一定条件下(如温度、展层剂的组成、 层析纸质量等不变),某种物质的R ),某种物质的 层析纸质量等不变),某种物质的 f 值是常 因此可作为定性依据。 数,因此可作为定性依据。 由于氨基酸无色, 由于氨基酸无色,可利用茚三酮反应使 氨基酸层析斑点显色,从而作定性分析。 氨基酸层析斑点显色,从而作定性分析。本 实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、操作
1. 在层析缸中装入展层剂,其高度约 ~2cm。 在层析缸中装入展层剂,其高度约1.5~ 。 2. 准备滤纸 戴上手套,取层析滤纸(长22 cm、 准备滤纸: 戴上手套,取层析滤纸( 、 宽14 cm)一张,在纸的一端距边缘 )一张,在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画 处用铅笔画 一条直线,在此直线上每间隔2cm作一记号,为点 作一记号, 一条直线,在此直线上每间隔 作一记号 样位置(即原点),如图。注意事项: ),如图 样位置(即原点),如图。注意事项:手不能直接 接触滤纸;直线与底边平行。 接触滤纸;直线与底边平行。 3. 点样:用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 点样:用毛细管依次 依次将 赖 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这 和混合样品 脯、 缬、 亮 和混合样品分别点在这 6个位置上,点样点干后再点一次。注意每点在纸 个位置上, 个位置上 点样点干后再点一次。 上扩散的直径,最大不超过3mm。 上扩散的直径,最大不超过 。

Lys

Gly

Pro Val

Leu 混合样品

纸层析点样标准图

4、展层:将点好样的滤纸(点样面朝外)卷成筒 、展层:将点好样的滤纸 点样面朝外 点样面朝外) 用透明胶纸粘接或用线缝好, 状,用透明胶纸粘接或用线缝好,纸的两边不 能接触。将滤纸直立于层析缸中(注意: 能接触。将滤纸直立于层析缸中(注意:点样 的一端在下,展层剂的液面需低于点样线1cm , 的一端在下,展层剂的液面需低于点样线 滤纸勿与缸壁接触),盖好层析缸盖,进行展 ),盖好层析缸盖 滤纸勿与缸壁接触),盖好层析缸盖,进行展 待溶剂上升15~ 层。待溶剂上升 ~20 cm时,取出滤纸,用铅 时 取出滤纸, 笔描出溶剂前沿界线,电吹风吹干。 笔描出溶剂前沿界线,电吹风吹干。 5、显色: 用喷雾器均匀喷上 %水合茚三酮 、显色: 用喷雾器均匀喷上0.1% 正丁醇溶液,然后用电吹风吹干 电吹风吹干即可显出各层 正丁醇溶液,然后用电吹风吹干即可显出各层 析斑点。 析斑点。

溶剂前沿

Y X

卷成筒状的滤纸

氨基酸显色后的图谱

四、计算: 计算:
用直尺测量并计算出各种氨基酸的R 用直尺测量并计算出各种氨基酸的 f值。
原点到层析点中心的距离 X Rf = = 原点到溶剂前沿的距离 Y
样品aa 样品 赖氨酸 甘氨酸 脯氨酸 缬氨酸 亮氨酸 标准aaRf 标准 混合aaRf 混合

试剂和器材: 试剂和器材: 1. 试剂: 试剂:
(1) 氨基酸溶液:0.5% (m/V)的赖氨酸、脯氨酸、缬氨 氨基酸溶液: 的赖氨酸、脯氨酸、 的赖氨酸 苯丙氨酸、 酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 (各组分的浓 各组分的浓 度均为0.5% 。 度均为 %)。 (2) 展层剂:正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3 (V/V)。 展层剂:正丁醇∶冰醋酸∶ ∶ ∶ 。 (3) 显色剂:0.1% (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 显色剂: % 水合茚三酮正丁醇溶液

2. 器材: 器材:
层析缸;层析滤纸(新华一号);毛细管 喷雾器 层析缸;层析滤纸(新华一号);毛细管;喷雾器;电 );毛细管 喷雾器; 吹风;直尺;铅笔; 吹风;直尺;铅笔;针线或透明胶带 ;一次性手套 。


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