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清华大学2001年本科分子生物学期末复习提纲

清华大学2001年本科分子生物学期末复习提纲

复习提纲(2001 版) 1.名词解释 (1) 基因组(genome) The sum of all the genes and intergenic DNA on all the different chromosomes of a cell is referred to as the cellular genome. (2) DNA 测序法 Sanger (dideoxy) method:以 DNA 单链作为模板,加入 DNA 聚合酶和四种 dNTP,分别加入少量的 ddNTP,在聚合酶的 作用下,ddNTP 随机掺入复制链中,由于 ddNTP 的 3’端没有羟基,加入后终止聚合反应,形成不同长度的 DNA 片 段。将这些寡核苷酸片段进行电泳分析(能区分长度仅差一个核苷酸),并用 35S 放射自显影,读出 DNA 上的核苷酸序 列。 (3) RFLP(p123 of Gene VI) RFLP (restriction fragment length polymorphism )限制性片段长度多态性(限制性片段指“限制性内切酶酶切片段” )即同 种不同个体的基因组在用同一种限制性内切酶作用时,限制性酶切图不同的现象。 〔限制性酶切图与基因功能无关,它 的多态性也不一定导致表现型的改变,可以作为 genetic marker〕 (4) SNP(Single nucleotide polymorphisms) SNP 指基因组水平上由单核苷酸改变引起的 DNA 序列多态性。 它是人类可遗传变异中最常见的一种, 占所有已知多态 性的 90%,是遗传变异的关键指标。SNP 在人类基因组中广泛存在,平均每 500 到 1000 个碱基对就有一个 SNP 发生, 估计总数可达 300 万个,甚至更多。SNP 既能在编码区又能在非编码区中发生。总的来说,位于编码区的 SNP(coding SNP)较少,但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义。由于特殊基因上的 SNP 很可能对疾病易感性、对于环境因子 和药物的反应有所作用,所以引起了许多科学家和制药公司重视。在我国强伯勤主持的中华民族基因组 SNP 研究计划 也于今年启动。另外,人类基因组计划旨在解读人类分布在 24 条染色体上的 30 亿对碱基。面对如此庞大信息量,人 类基因组测序的策略是以作图为基础,将染色体分为易操作的结构区域。第三代分子标记就是 SNP,这使得遗传图谱 的制作日益精密。 (第一代是限制性酶切片段长度多态性(RFLP) ,第二代是短串联重复序列(STR) ) (5) 遗传图(p122 of Gene VI) :染色体上可变部位的线性排列,由基因重组实验推断出来。 (6) 物理图:A map of the locations of identifiable landmarks on DNA.(如限制性酶切位点),以 bp 为单位。 (7) 叶盘法:叶盘法是常用的植物转基因方法,它是新切的叶圆孔片与农杆菌在培养基上共培养 2 天,使农杆菌侵染植 物细胞,再转至筛选配养基上筛选转化了的细胞(先杀死农杆菌,再加入抗生素杀死未转入农杆菌质粒的植物细胞) 。 将存活的植物细胞培养形成愈伤组织后,转入合适的配养基中培养为含 Ti 质粒转化基因的植株。 (8) Ti 质粒(p443) :即肿瘤诱导质粒,1971 年由 Schell 在农杆菌中发现,能使植物产生冠瘿瘤。Ti 质粒为双链环状 DNA 分子,约 200-250kb。四个重要区域为:复制起始点 OriV、致病区(Vir region)、T-DNA 区和农杆碱分解代谢区。 Vir 区转录单位对于农杆菌转化细胞至关重要,但是此区只有受到植物细胞释放的信号分子(如乙酰丁香酮、羟基乙酰 丁香酮)刺激才能表达。T-DNA(transfer DNA)是 Ti 质粒上能被整合到植物核 DNA 上的片段, 。含有 Ocs、Roi、Shi 等基因。T-DNA 两端各有一个 25bp 长的高度保守的正向重复序列,其中右边界序列对于 T-DNA 的转移至关重要。只 要两端序列存在且方向正确,那么,在两端序列中间插入任何一个 DNA 片段都可能被转移整合到植物基因组中去。这 也是我们用 Ti 质粒进行遗传转化的理论基础。 (9) 功能基因组(functional genomics) 结构基因组学是基因组分析的早期阶段,以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学是利用结

构基因组学提供的信息,系统的研究基因功能。他以高通量、大规模的实验方法及统计与计算机分析为特征。 (10) 重组植物 利用植物基因工程的手段,在离体条件下按照人们的目的对植物的 DNA 进行操作,培育新的植株,达到改良植物性状 的目的,这样获得的植物即转基因植物。 (11) 蛋白质组(proteome) 此概念是澳大利亚学者 Wasinger 等于 1994 年提出的, 指的是由基因组编码的全部蛋白质。 从这个定义看蛋白质组内的 蛋白质数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因数(准确的说是 ORF 的数目) ,但在生物体内这样的蛋白质组是不存 在的。从基因表达的角度说蛋白质组内的蛋白质数目总少于基因组中开放阅读框的数目;但是从蛋白质修饰的角度说 蛋白质数目又远多于基因组中开放阅读框的数目。基因组基本上固定不变,而蛋白质组是动态的,具有时空性和可调 节性,能反映基因的表达时间、表达量、蛋白质的翻译后加工和亚细胞分布。 (12) YAC 载体(yeast artificial chromosome)(p639 fig20.13 of Gene VI) :YAC 含有在酵母中增殖一个染色体所必需的序 列元素,一个复制起点,一个确保分离进入子细胞的着丝点和封闭染色体末端的端粒。YAC 还带有三个选择标记 (selectable marker):TRP1、URA3 和 SUP4(中间含有 SmaI 克隆位点)。在载入外源 DNA 前 YAC 保持环状状态。端粒 序列后是 BamH1 酶切位点, BamH1 切割产生线性分子, 用 末端是与完整的染色体相似的保证了线性分子稳定的端粒。 用 SmaI 酶切产生平齐末端,DNA 可以在此插入。因此两个酶切同时进行就得到了两个线性片段(two “arms”),每一 个在一端含有端粒, 另一端有可以连接的平末端。 每个臂有一个选择标记, 可以用来选出两个臂都被连接的分子。 SUP4 标记的丧失使得再连接的 YAC 与未打开的 YAC 得以区分。一个 YAC 载体可以携带大量的 DNA,插入 300kb 并不稀 罕。与质粒相比,这几乎提高了一个数量级。 (13) 功能筛选(function screening) (14) 染色体步行(chromosome walking) (p637 fig20.12 of Gene VI)

我们从一个已经分离的基因克隆开始,这个克隆含有一个已知基因,或者从遗传图上知道它在某个我们感兴趣的区域 附近。为了使大片段便于操作,我们用来自前一个克隆一端的亚片段,来分离下一个片段。具体方法:我们从原始克 隆亚克隆出相应片段 (subcloning: 把 DNA 片段从某一载体上克隆到另一载体上) 。 然后从文库中辨认出与这个克隆重 叠的其他嵌合载体。这些载体将在携带第一个克隆片段的一端延伸。我们可以通过制作每个片段的限制性图来确定延 伸方向,这张用新的材料延伸的图应该含有与第一个克隆一端相同的片段。不断重复这一过程。原则上,可能步行上 百 kb,并且基因组中超过 1000kb 的区域也曾用这种方法作图。 (15) 定位克隆(positional cloning) The identification of a gene based solely on its position in the Genome.经典定位克隆纯粹依赖连锁分析进行染色体定位。 定 位候选克隆(positional candidate cloning)是它的发展与改进。在克隆遗传病 优点:不需要知道基因产物的功能;基因的生化、生理学、病理学、生物学特均非必需。 不足:不能显示基因产物的功能;对于基因功能的认识依赖于与已知功能基因产物的序列同源性;基因组计划不断减 少这一事件的可能性。 (16) 转座子:(transponson ) 存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位, 最简单的转座子不含任何宿主基因而常被称为插入序列 (insertion sequence,IS) ,它是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。IS 序列都是可以独立存在的单元,带有介导自身移动的 蛋白。IS 两末端为倒置重复序列,转座时往往复制宿主靶位点一段 DNA,形成位于 IS 序列两端的正向重复区。

(17) 转座子示踪(transponson tagging) 又称转座子标签,原理:利用转座子的插入造成基因突变,以转座子序列为基础,从突变株的基因文库中筛选出带有 此转座子的克隆,它必含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列,再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完 整的基因。根据目的不同,可以采取定向标签(directed tagging)随机标签(random tagging)两种标签策略。这一方法的优 点是:可以在不了解基因产物大的生化性质和表达模式的情况下分离克隆植物基因。 2.思考题 1)简述植物对人类的重要贡献 答:a.光合作用:利用光能 CO2+H2O 制造 O2 和有机物,能量的“固定” 。b.食物来源。c.环境保护:保持水土、防止 风沙。d.重要的实验材料。e.药物与保健品 2)简述制作转基因植物的步骤 答:A.目标基因的克隆。 Strategies:a. 如果有产物的:若为 protein 则测部分氨基酸序列,合成探针筛选 cDNA 文库;若为 DNA,则切成片段, 接入表达载体表达,进行抗体筛选和功能筛选;或者在 cDNA 大规模分析的基础上进行同源收缩,找出可能的目标基 因。 b. 无产物的可以采用转座子示踪、Ti 质粒插入法、定位克隆、cDNA 差式显示等方法克隆其基因。 B.植物表达载体的构建:在基因的 5’端加上启动子(如 35S 启动子) ,3’端加上终止子。 C.植物的遗传转化: 主要方法有:a.Ti 质粒及 Ri 质粒为载体的转化系统;b.以 PEG 介导的原生质体化学转化系统;c. 电激法;d.用基因枪 转入愈伤组织后培养;e.显微注射(micro-injection);f.病毒感染。 D.转化植物细胞的筛选及转基因植物鉴定引起表现型变化的可以通过观察表现型改变而找出成功转入的植株;可以通 过 报告 基因 或筛 选标记基 因来 判断 ;也 可以在 DNA、RNA、 protein 三个 水平 上鉴 定转 入基因及 其表 达情 况 (Southern/Northern/Western blotting)来确认。 3)简述用 Ti 质粒(农杆菌)转化外源基因的分子机制 答:用 Ti 质粒进行遗传转化的理论基础是:在 T-DNA 两端正向重复序列中间插入任何一个 DNA 片段都可能被转移整 合到植物基因组中去。另外,去掉 T-DNA 上的致瘤因子,造成 T-DNA 大段缺失,或在 T-DNA 上插入外源基因并不影 响 T-DNA 的转移整合功能。并且由于 Vir 区对于 T-DNA 的转移是通过反式作用因子来实现,所以 Vir 区与 T-DNA 区 可以分别位于两个复制子上。基于以上性质,发展出了两个主要的 Ti 质粒载体系统,即共整合载体系统和双元载体系 统。 共整合载体系统(cointergrate vector),Ti 质粒上编码致癌基因及冠瘿瘤碱基序列常为一段 pBR322DNA 所代替,当外源 基因的 pBR322 衍生中间载体由大肠杆菌进入农杆菌细胞后,两者相同的 pBR322 序列间发生同源同组,导致外源基因 整合到 Ti 质粒上。 双元载体包含两个质粒,它们都能在农杆菌中复制,其中一个 Ti 质粒(不含 T-DNA,且左边区与右边区被修饰)提供 Vir 功能,另一个广宿主范围的质粒携带目的基因和植物选择性标记基因及移动和复制功能基因这两种系统的中间载体由 大肠杆菌转移到 壤农杆菌中都需要第三种菌参与,也称三亲交配(triparental mating)。 Ti 质粒的遗传转化:植物受伤后,伤口细胞分泌大量的酚类化合物(如乙酰丁香酮),它们是农杆菌识别敏感植物的信号

分子。农杆菌立即趋向这些细胞,最终导致 T-DNA 的转移。跟据这一性质建立了叶盘法转化系统。 4) 全基因组鸟枪法测序的主要步骤 5)SNP 解析的目的和意义 答:a. SNP 继 RFLP、STR 后称为第三代基因组作图的多态性标记,使得遗传图谱的制作更精细,并且适合自动化大规 模扫描。 b. 由于 SNP 被认为是一种能够稳定遗传的早期突变,他们之间存在着连锁不平衡,与疾病存在着稳定的相关性, 所以 SNP 是研究基因组多态性和识别、定位疾病相关基因的一种新工具。 c. 存在于编码区以及其紧邻上下游序列中的 SNP,可以改变基因的表达水平和表达产物的功能。 d. 特殊基因上的 SNP 可能直接关系到人类对于疾病的易感性和对于环境因子和药物的反应性。因此 SNP 可能将为 根据个体的多态性开展药物设计和对特殊群体制订服药剂量提供依据。 6) 如何提高蛋白质的热稳定性,提高热稳定性的必要性和可能性。 答:(1)可能性:噬热菌(如有些远古细菌可以耐受 100 度以上的环境)以及其它生活在高温环境下的生物体内的酶热稳 定。 (2)必要性:酶在各种变性剂下的稳定性是阻碍酶的广泛使用的最大问题之一,而当一个酶热稳定时,它通常很可能对 于其它使其三级结构去折叠的因素也稳定。另外,在高温下工作,有许多优点:a. 每升高 10 度,反应速度加倍;b. 温 度超过 60 度时抑制了微生物的生长;c. 在许多条件下,温度升高使底物溶解度升高,液粘度下降;d. 对于吸热反应 提高温度使平衡向产物方向移动。科研、生产中十分需要能在较高温度下发挥作用的酶,如加酶洗衣粉。 (3)方法:化学修饰、酶的固定化、蛋白质工程、添加剂 ①利用自然界热稳定的酶寻找自然界中同源的热稳定的酶,一般在生活在 60 度以上的嗜热微生物中。几乎所用的嗜热 菌可以在菌种收藏中心 DSM 得到。如果在某种生物中酶的量适合,则用它发酵。否则克隆它的基因,插入载体转入微 生物中。如:DNA 聚合酶、糖代谢酶 ②嗜热菌中与嗜温菌中酶的比较一些氨基酸发生了代换:Gly->Ala、Ser->Ala、Lys->Arg 等产生了以下影响 a.堆积紧密(表面积与体积比小稳定性高) b.静电相互作用增加(形成更多离子对如 Lys->Arg) c.增加二硫桥、增加疏水相互作用 d.增加氢键 e.微环境(渗透压、钙离子) f.糖基化(多聚糖保持包围蛋白质的水化层、与表面的亲水氨基酸形成氢键、碳水化合物与临近肽的立体相互作用稳定 了蛋白质的构象、使变性或部分变性的状态更易溶阻止聚集、遮掩酶切位点,减少蛋白酶水解所必须的构象变化) ③蛋白质工程: 只有一些氨基酸的替换对于热稳定性的提高是必要的。蛋白质工程方法:随机突变、site directed mutagenesis。

a. random mutagenesis:制备所有可能的单位点随机突变文库,筛选热稳定性提高的几个突变株,为定点突变提供信息; 或者采用 evolutionary molecular engineering 方法: 编码目标蛋白的基因转入极端嗜热菌中, 在必需酶才能存活的条件下 培养,提高温度选择能生存的菌,测序分析突变点。后两步可以重复以逐渐升温接近要求温度。 b. site directed mutagenesis:oligonucleotides directed mutagenesis; overlap extension PCR ④化学修饰:是使蛋白质稳定化的重要和有效的方法之一,必需避开活性部位关键基团;交联的原理是通过在两部分 间桥连,增加结构的刚性,但往往降低活性; ⑤酶的固定化:减少亚基分离,解聚 ⑥添加剂: a. 个别情况下底物或底物类似物能够稳定酶,如 NAD 依赖性脱氢酶: b. 表面自由能改变了蛋白质溶液相互作用:有机分子、盐、氨基酸盐等 c. 低分子量溶质:sugar 是好的蛋白质稳定剂,甘油有些特殊。 d. 聚合物溶质如 PEG 对 invertase 的稳定作用 (4)如何作出选择: a. 收集关于蛋白的尽可能多的信息,决定最佳的目标和我们可以采用的方法 b. 有时简单的添加剂比我们进行全面的定位突变更有效的达到要求 c. 方法是否合适依赖于方程:interest=剩余活力×寿命,必需考虑稳定化过程的价格与酶的价格的比例。 d. 固定化酶在工业上的应用,优势是不需要了解太多的酶的结构信息,不足是酶要相对高纯;随机突变介于固定化和 定位突变之间,我们只需知道 cDNA 信息,最终筛选出好的廉价的酶源,但并不总能成功;定位突变可以产生要求的 氨基酸改变,可以对酶结构的稳定及相互作用有深入的了解;酶配方(添加剂)是一个重要参数;化学修饰提供了一个有 效的方法,但是无法提前预知。 7)如何得到一个菌种 答:获得菌种的途径: (1) 从 ATCC、CGMCC 等菌种收藏中心购买 (2) 从自然环境中筛选 (3) 遗传工程: 将目标基因插入人工质粒中,筛选好的菌种 (4) 突变: 通过化学、物理或者生物的方法 (5) 细胞生物学技术:原生质体融合 在保持渗透压平衡的条件下除去细胞壁(提高了遗传重组率) ,在融合剂(如 PEG)的存在下,原生质体融合形成杂合体 或双倍体,融合原生质体细胞的再生。主要不足是不稳定。

8)为什么要进行摇瓶实验,可得到什么结果 答:进行摇瓶实验的目的是优化细胞生长和产物生产的条件,为进一步放大,直至工业化提供依据。主要条件有:a. PH 值;b.温度;c.溶氧;d.底物选择:最大和最优底物浓度 e.其他条件:如限氮、限磷对于发酵结果的影响等等 9)如果你是一个抗生素工程师,如何设计生产过程 答:a. 分离或者从菌种收藏中心获得待选菌种 b. 筛选有抗菌活性的菌种 c. 开发浸没培养生产方法 d. 开发分离纯化抗生素的方法 e. 确定抗生素的性质:物理性质,如吸附(adsorption)与吸收(absorption); 化学性质,如反应性,溶剂中的溶解度,对于 酸、碱、热的稳定性 f. 抗生素评估 g. 药理实验 h. 抗菌活性 i. 与已有抗生素性能的比较 j. 开发实验工厂规模(pilot plant)的生产方法 k. 申请临床实验的许可 l. 实验提纯的抗生素 m. 开发工厂车间规模(plant scale)的生产方法 n. 获得面向临床应用的生产许可 o. 其它各种各样的考虑 p. 开发抗生素生产控制方法 q. 新应用的开发 r. Development of marketing and distribution system s. Financing of business 10)什么是固定化酶,固定化的方法,举例 通过吸附、包埋、交联、化学偶联等固定化技术将水溶性的酶固定在水不溶性的载体上得到水不溶性的酶,称为固定 化酶。优点是:不溶于水,易于与产物分离;可反复使用;稳定性好;可连续生产。缺点是:固定化过程中往往会引 起酶的失活。常用固定化技术有:微型胶囊、吸附、胶格包埋、双功能试剂共价交联、化学偶联。

A. 微型胶囊法:酶被包埋在 1-100μm 的胶囊中,底物与产物可以自由过膜。a. 相分离法(醋酸纤维素:β-D-半乳糖 苷酶、天冬酰胺酶;火棉胶:脲酶)。b. 界面聚合法:尼龙 66。c. 液膜法:聚脲。d. 液体干燥法 B. 吸附法: 物理吸附 (静止法, 电沉积法, 反应器表面直接沉积法, 荡浴或混合浴沉积法) 离子吸附 , (DEAE-cellulose, DEAE-sephadex A-50) C. 胶格包埋法:N,N‘-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺 D. 双功能试剂交联法:戊二醛 E. 不溶性载体共价耦联法 11)蓝细菌 gene recombination 常规步骤: 答: a. PCR 扩增目标基因片断 b. 基因的分子克隆:将目标基因克隆到 pUC 系列的含 lacZ 基因的质粒中,在 X-gal 平板上,通过检查因α互补消失产 生的白色菌落就可以带有重组质粒的蓝细菌 c. DNA 体外重组构建新的质粒:gene deletion 和 gene interruption 质粒的构建 d. 用质粒转化 对 细胞,筛选突变体质粒: e. 突变体 DNA 的 PCR 检测和 Southern blot 分析 12)吴庆余构建的基因缺失突变体 FRXC 还能作什么工作 a. frxc-突变体在黑暗条件长期培养,蓝细菌 PCC6803 由自养向异养转变(利用 Glucose)。这一过程必然涉及一系列基因 的开启表达。为克隆相关的基因提供了可能。 b.叶绿素与叶绿素结合蛋白相互作用及与对内囊体膜形成的调控: 研究表明叶绿素的消失可以导致类囊体膜的消失,而 frxc-突变体在黑暗条件不合成叶绿素,在光照条件下可以合成叶 绿素的性质为我们研究内囊体、光合系统组装的动态性质、以及叶绿素与叶绿素结合蛋白相互作用提供了很好的系统。 c. frxc-突变体在黑暗条件长期培养,蓝藻的叶绿素含量很低,这可能给蓝藻的热模拟降解产物带来差异。由于其它大 分子的合成未受影响,与正常蓝藻比较就可以发现蓝藻热模拟降解产物中那些组份来源于叶绿素。这可能给出对于重 要的标志物分子的前体母质来源信息。 d 红藻与蓝藻藻胆体中含有一类捕光色素复合蛋白-藻胆蛋白。frxc-突变体在黑暗条件合成叶绿素受阻,可能对藻胆 蛋白的代谢产生影响。并且类囊体膜的解体也使得藻胆体的定位与装配发生改变。 e. frxc-突变抑制了将原叶绿素酸酯转化为叶绿素的原叶绿素酸酯还原酶活性,必然造成上游的原叶绿素酸酯的积累, 以及其它上游物质的积累,通过光控开关,研究叶绿素代谢途径。 f. 用 cDNA 差式显示或基因芯片技术对于有光条件下以及暗条件下,正常以及 frxc-突变体基因表达谱进行分析,通过 比较找出受 frxc 调控的基因(即位于 frxc 下游的基因) ,并且分析 frxc 是否参与了光途径下叶绿素的合成。 13)利用已获得蛋白克隆其基因 答:首先根据研究工作的目的和性状的生理生化特性,分离纯化所需蛋白质和多肽,并对它进行部分氨基酸序列分析 或制备单克隆抗体。

PCR 扩增。根据所得的氨基酸序列推出可能的核苷酸序列,人工合成两个简并的核苷酸引物,以染色体 DNA 或第一 链 cDNA 为模板进行扩增,从而得到目的基因片段。 构建 cDNA 文库。 对于组织中含量丰富的基因: 根据基因表达部位或特异性选取一定的组织提取总 RNA, 制备 poly (A) RNA,经过逆转录酶作用合成第一链 cDNA,并以此为模板,在 DNA 聚合酶的作用下合成第二链 cDNA。然后选择合 适的载体构建 cDNA 文库。根据所推测的核苷酸序列合成探针,进行菌落或 菌斑原位杂交,筛选重组克隆,并进行 序列测定。 构建基因组文库。用内切酶将高相对分子量的染色体 DNA 部分消化,并选择合适的载体(如噬菌体或 cosmid 载体建立 基因组文库),然后用人工合成的寡聚核苷酸或以其 cDNA 克隆等同源性片段为探针筛选目的基因克隆,也可以利用所 制备的抗体通过放射性筛选分离目的基因克隆。 14)什么叫生物芯片, 其最大特点生物芯片指能对生物分子进行快速并行处理和分析的指甲盖大小的薄型固体器件。 (实 际上也可以作化学分子分析)与电子芯片比:在材料、制作工艺、输出信号、使复杂的系统变小方面相同;但是前者 输入的是液体生物材料,一次性使用;后者可永久使用,输入为电信号。 15)生化实验的常规步骤,将三个步骤集成起来有什么好处 常规步骤:样品制备(collection、storage、classification) 、生物化学反应、结果检测。 优点:提高分析速度、降低样品和试剂的消耗量、使实验室微型化、提高了检测精度、实验结果的数字化便于应用网 络 (16) 如何开展 PHA 大规模生产 答:创业之路: (1) 市场调查与预测、 文献调研: 分析开发产品的前景、 评估从实验室工作转化为工业大生产的周期、 以及市场竞争力, 以决定工作方向。 (2) 成本评估,项目的规划:总投资纲要(固定资本、直接成本 (土地、建筑物、保障等)、简介成本 (工程、建筑、意 外、酬金)、启动资金、营运资金) (3) 寻找合作伙伴:技术、资金、人力、硬件支持。 (4) 组织攻关团队,设计研究技划:实验室工作->工业化 (5) 实验室工作: ①菌种筛选 ②摇瓶实验(优化细胞生长和产物生产的条件,主要条件有:a PH 值;b.温度;c.溶氧;d.底物选择:最大和最优底物浓 度 e.其他条件:如限氮、限磷对于发酵结果的影响等等。为进一步放大,直至工业化提供依据。) ③实验室规模的发酵(5-10 L 发酵罐):发酵流程的选取 Batch(一批) process ;Fed-batch process;Continuous process; Semi-continuous process(发酵罐的组成 Agitation, Cooling and heating, Air inlet and outlet, pH control, Nutrient addition Inoculation, Viewing por) ④Pilot 规模的发酵 (300-3000 L 发酵罐):测定从实验室发酵过程在半工业规模生产中的可行性。 ⑤在放大过程中可能遇到的问题:

随着体积增加,表面体积比减小,混合越发困难。对于有氧发酵,溶氧是个重要的指标,必须采取措施增加溶氧。如: 增加搅拌速度,增加压力,通纯氧,增加氧气入口等等。 (6) 发酵流程工业化(10,000-500,000 L) (7) 下游流程设计:将产物分离纯化 粗产品->过滤->沉淀经提取后性干燥后用作动物饲料, 提取物与上清经过各种方法(萃取、 亲和柱等)得到的提取物混 合->重结晶纯化->产物的纯品 (8) 产品的包装技术:包装消毒技术、食物或药品进行冰冻干燥包装、脱水包装(如干酵母)、一般的食品包装(如谷氨酸 钠)、对于注射剂除热源质和消毒、加盐包装、加添加剂防腐剂等 (9) 组建公司、产品宣传、大规模运营、股票等等。 (17) 生物技术的优势与不足: (1) 生物技术的优势:低温生产;液相反应;在发酵一步里完成多个反应;高度的自动控制化;可以进行手性分子合成; 污水易处理,污染小;生产复杂的化合物分子; Reliance on renewable feedstocks;Versatility with different feedstocks;Food, feed and drug applications;Fine chemicals to bulk chemical applications (2) 生物技术的不足: Feedstocks are oxidized and unsuitable for many applications;Sterilization is a major cost;Product often in dilute aqueous solutions; Product recovery costly; Equipment costs high; Reactions slow leading to poor volumetric productivity; Complicated reaction conditions;Mainly batch operation;High cell (catalyst) regeneration costs;High BOD wastes


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