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食品毒理学实验指导书_图文

食品毒理学实验指导书_图文

食品毒理学实验指导

郭红辉 刘永吉 编写

韶关学院英东食品科学与工程学院

2012 年 9 月

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实验注意事项
食品毒理学所开设实验均要用到实验动物,为保证实验安全顺利进行,特别提 出以下注意事项,所有实验人员务必认真阅读,严格遵守。 1. 遵守卫生部颁布实施的《医学实验动物管理实施细则》和广东省第十一届人民 代表大会常务委员会第十九次会议通过的《广东省实验动物管理条例》相关规 定,不得戏弄或者虐待实验动物。 2. 课前预习实验指导,熟悉实验操作流程,撰写预习报告。 3. 进入实验室后,到小组所在实验台进行实验操作,不要随意走动,大声喧哗; 抓取实验动物或解剖时要做好防护,防止被动物咬伤或抓伤、被实验器具扎伤 等意外事故发生;如有意外发生,马上报告老师。 4. 实验动物器官和尸体不要随意丢弃,交由班级指定负责人集中处理。 5. 实验结束后,清洗和整理好实验用具,交由老师清点后方可离开。

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实验一

实验动物的基本操作

一、目的和意义 毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验,通过对动物的实验观察和分析来 研究毒作用,获得毒物的毒性、剂量-反应关系、毒作用机制等各方面的资料,因此 掌握动物实验基本操作是毒理学研究必备技能。 二、实验器材及试剂 1、器材 大头针、泡沫板、帆布手套、橡胶手套、剪刀、棉签、小鼠鼠笼、1.5 及 0.5ml EP 管等 2、试剂 (1)3% ~ 5%苦味酸溶液(即2,4,6-三硝基苯酚) ,因与动物的被毛中 的蛋白发生反应,可染成较为牢固的亮黄色。可用水,也可用一定浓度的乙醇来配 制。 (2)0.5% 中性红或品红溶液,可染成红色。 三、内容 (一)健康动物的选择 无论选择哪种种属品系的动物进行实验,均要求选择健康的实验动物。健康动 物检查时要求达到:外观体形丰满,被毛浓密有光泽、紧贴体表,眼睛明亮,行动 迅速,反应灵活,食欲及营养状况良好。 (二)实验动物性别的鉴定 动物性别不同对毒物的敏感性也不同,这可能与性激素、肝微粒体羟基化反应 有关,也随受试物而异。因此,要根据实验要求选择性别,一般实验如对性别无特 殊要求者,以选用雌雄动物各半。 1.大鼠 、 小鼠主要以肛门与生殖器的距离区分, 间距大者为雄性, 小者为雌性, 成年鼠直接观察有无外露睾丸。 2.豚鼠 用一只手抓住豚鼠颈部,另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤,雄性动物在 圆孔中露出性器官的突出, 雌性动物则现出三角形间隙, 成年雌性胸部有二个乳头。 3.家兔可观察其阴部孔洞大小及其离肛门的距离。孔洞扁形略大,离肛门较近 的为母兔;孔洞圆形而小,离肛门较远的为公兔。对开眼后的仔兔和满月幼兔鉴别 公母时,右手抱定仔兔,腹部朝上,左手中指与食指夹住兔尾,拇指轻按,掰开后 阴部,生殖器孔即可张开,孔口类叶形有隙缝并呈“v”形的为母兔,孔口突出呈圆 形的为公兔。 (三)实验动物的抓取方法 1.小鼠 先用右手抓取鼠尾提起, 置于鼠笼或实验台上向后拉, 在其向前爬行时, 用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤, 将鼠体置于左手心中, 把后肢拉直, 以无名指按住鼠尾,小指按住后腿即可。 2.大鼠的抓取方法 基本同小鼠,但因大鼠凶猛,不宜采取袭击方法抓取。为避 免咬伤,可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法,用拇指和食指捏住鼠耳,余下 三指紧捏鼠背皮肤,置于左掌心中,这样右手可进行各种实验操作。 3.豚鼠的抓取方法 豚鼠胆小易惊,在抓取时要稳、准、迅速。用手掌迅速扣住 鼠背,抓住其肩胛上方,以拇指和食指环握颈部,另一只手托住臀部即可。 4.兔的抓取方法 用右手抓住兔颈部的毛皮提起,然后左手托住其臀部或腹部,
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让其体重的大部分重量集中在左手上。 (四)实验动物的编号、标记方法 1.称重 大、小鼠秤的感应量需在 0.1g 以下。根据实验的不同要求,选择一定数 量的大小鼠,体重要求在同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的 10%, 不同组间同性别动物体重均值差异应小于 5%。 2.编号 (1)染色法:一般用苦味酸。一般头部为 1,右前腿为 2,右腰为 3,右后腿 为 4,尾基部为 5,左后腿为 6,左腰为 7,左前腿为 8,背部为 9。 双色涂染法是采用两种颜色同时进行染色标记的方法。例如用苦味酸(黄色) 染色标记作为个位数,用品红(红色)染色标记作为十位数。此法略嫌烦杂。

(2)剪耳法

(3)烙印或剪毛法

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(4)号牌法 (5)植入芯片法 采用独特专利技术,直径 2mm 长 11mm 的 IMI-1000 识别芯片在植入后在动物组 织内保持位置固定,不会任意移动。 在研究结束后,可以和需要保存的组织一起低温保 存或液体保存,即使经过几十年的长期保存,仍然可以马上读取数据。

(五)实验动物的随机分组法
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动物实验时,常常需要将选择好的实验动物,按研究需要分成若干个组,分组 时为了避免人为的因素影响常应用随机数字表进行完全随机化的分组。 (六)实验动物的被毛去除方法 1.剪毛(1)把剪刀贴近皮肤剪,不可用手提起被毛,以免剪破皮肤; (2)依次 剪毛,不要乱剪; (3)剪下来的被毛集中在一个容器内,勿遗留在手术野和操作台 周围。 2.拔毛 3.脱毛 (七)实验动物染毒途径和方法 1.皮下注射 皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织,经毛细血管、淋巴管吸收进入血液 循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时,常规消毒注射部位 皮肤,然后将皮肤提起,注射针头取一钝角角度刺入皮下,把针头轻轻向左右摆动, 易摆动则表示已刺入皮下,再轻轻抽吸,如无回血,可缓慢地将药物注入皮下。拔 针时左手拇、食指捏住进针部位片刻,以防止药物外漏。注射量约为 0.1-0.3ml/10g 体重。 2.皮内注射 是将药液注入皮肤的表皮河真皮之间, 观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应, 接种、过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位的被毛剪掉,局部常规消毒,左 手拇指和食指按住皮肤使之绷紧,在两指之间,用结核菌素注射器连接 4.5 针头穿 刺,针头进入皮肤浅层,再向上挑起并梢刺入,将药液注入皮内。注射后皮肤出现 一白色小皮丘,而皮肤上的毛孔极为明显。注射量为 0.1ml/次。 3.肌肉注射 小鼠体积小,肌肉少,很少采用肌肉注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油 或其他溶剂中的药物时,采用肌肉注射。操作时 1 人保定小鼠,另一人用左手抓住 小鼠的 1 条后肢,右手拿注射器。将注射器与半腱肌呈 90°角迅速插入 1/4,注入药 液.用药量不超过 0.1ml/10g 体重. 4.腹腔注射 左手提起并固定小鼠,使鼠腹部朝上,鼠头略低于尾部,右手持注射器将针头 在下腹部靠近腹白线的两恻进行穿刺,针头刺入皮肤后进针 3mm 左右,接着使注 射针头与皮肤呈 45°角刺入腹肌,穿过腹肌进入腹膜腔,当针尖穿过腹肌进入腹膜 腔后抵抗感消失。固定针头,保持针尖不动,回抽针栓,如无回血、肠液和尿液后 即可注射药液。注射量为 0.1-0.2ml/10g 体重。 5.静脉注射 (1)兔:常用耳外缘静脉; (2)大小白鼠:一般为静脉注射(左右二侧的) ; 小白鼠和大白鼠:一般采用尾静脉注射,鼠尾静脉有三根,左右两侧及背侧各 一根,左右两侧尾静脉比较容易固定,多采用,背侧一根也可采用,但位置容易固 定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中,使尾巴露出,尾部用 45~50℃的 温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张,并可使表皮角质软化,以左手拇指和食 指捏住鼠尾两侧,使静脉充盈,用中指从下面托起尾巴,以无名指和小指夹住尾巴 的末梢,右手持注射器连 4(1/2)号细针头,使针头与静脉平行(小于 30℃) ,从尾下 四分之一处(约距尾尖 2-3 厘米)处进针,此处皮薄易于刺入,先缓注少量药液, 如无阻力,表示针头已进入静脉,可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以
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止血。如需反复注射,应尽可能从末端开始,以后向尾根部方向移动注射。
表 1 常用实验动物的最大给药量和使用针头规格
动物名称 小白鼠 大白鼠 项 目 灌 胃 1ml 9(钝头) 1ml 静脉切 使用针头 鼠 最大给药量 使用针头 兔 最大给药量 使用针头 猫 最大给药量使用 针头 蛙 开 针 3ml 静脉切 开 针 20ml 10 号 导尿管 20ml 10 号 导尿管 淋巴囊注射 7 7 最大注射量 1ml/只 7 6 6(1/2) 20ml 6(1/2) 2ml 7 5ml 6 10ml 6(1/2) 2ml 6(1/2) 2ml 7 5ml 5 10ml 6 1ml 6 0.5ml 6 4ml 5 5ml 皮下注射 0.4ml 5(1/2) 1ml 肌肉注射 0.4ml 5(1/2) 0.4ml 腹腔注射 1ml 5(1/2) 2ml 静脉注射 0.8ml 4 4ml

最大给药量 使用针头 最大给药量

6.经口染毒:灌胃 在急性试验中,经口给药多用灌胃法,此法剂量准确,适用于小白鼠、大白鼠、 家兔等动物。 小鼠、大鼠(或豚鼠)用输血针头或小号腰穿针头,将其尖端斜面磨剂, 用焊锡在针尖周围焊一圆头,注意勿堵塞针孔,即成灌胃针;亦可用烧成圆头的硬 质玻璃毛细管或特制的塑料毛细秋,作为导管。灌胃时将针按在注射器上,吸入药 液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定,右手持注射器,将灌胃针插入动物口 中,沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位,针插入时应无阻力。若感到 阻力或动物挣扎时,应立即停止进针或将针拔出,以兔损伤或穿破食道以及误入气 管。 一般当灌胃针插入小鼠 3-4cm,大鼠或豚鼠 4-6cm 后可将药物注入。常 用的灌胃量小鼠为 0.2-1ml,大鼠 1-4ml,豚鼠为 1-5ml。 7.其他途径给药: (1)呼吸道染毒 (2)皮肤染毒:a.斑贴法;b.浸尾法 (八)实验动物生物材料采集和制备 (八)动物常用采血方法 (1)大小鼠鼠尾采血法:剪尾法或尾静脉采血 剪尾法 当所需血量很少时采用本法。 固定动物并露出鼠尾。 将尾部毛剪去后消 毒,然后浸在 45℃左右的温水中数分钟,使尾部血管充盈。再将尾擦干,用锐器(刀 或剪刀)割去尾尖 0.3-0.5cm,让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取,采血结 束,伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口,割破尾动脉或静脉,收集血液 的方法同上。 每鼠一般可采血 10 余次以上。 小鼠每次可取血 0.1ml, 大鼠 0.3~0.5ml。
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鼠尾静脉刺血法 大鼠用血量不多时(仅做白细胞计数或血红蛋白检查),可采用 本法。先将鼠尾用温水擦拭,再用酒精消毒和擦拭,使鼠尾充血。用 7 号或 8 号注 射针头,刺入鼠尾静脉,拔出针头时即有血滴出,一次可采集 10~50mm3。如果长 期反复取血,应先靠近鼠尾末端穿刺,以后再逐渐向近心端穿刺。 (2)眼眶静脉丛采血法 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上 纱手套),应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧,使 眶后静脉丛充血。右手持续接 7 号针头的 1ml 注射器或长颈(3~4cm)硬质玻璃滴管 (毛细管内径 0.5-1.0mm),使采血器与鼠面成 45℃的夹角,由眼内角刺入,针头斜 面先向眼球,刺入后再转 180 度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度,小鼠约 2~3mm, 大鼠约 4~5mm。当感到有阻力时即停止推进,同时,将针退出约 0.1-0.5mm,边退 边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中,当得到所需的血量后,即除去加于颈 部的压力,同时,将采血器拔出,以防止术后穿刺孔出血。 若技术熟练,用本法短 期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重 20-25g 的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml;体重 200-300g 大鼠每次可采血 0.5-1.0ml,可适用于某些生物化学项目的 检验。 (3)腹主动脉或股动/静脉采血法 腹主动脉采血 最好先将动物麻醉, 仰卧固定在手术架上, 从腹正中线皮肤切开 腹腔,使腹主动脉清楚暴露。用注射器吸出血液,防止溶血。或用无齿镊子剥离结 缔组织,夹住动脉近心端,用尖头手术剪刀,剪断动脉,使血液喷入盛器。 股动(静)脉采血 先由助手握住动物,采血者左手拉直动物下肢,使静脉充盈。 或者以搏动为指标,右手用注射器刺入血管。体重 15-20g 小鼠采血约 0.2-0.8ml, 大鼠约 0.4-0.6ml。 (4)断头采血法 采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大(小)鼠的颈部皮肤,并作动物头 朝下倾的姿势。 右手用剪刀猛剪鼠颈, 约 1/2-4/5 的颈部前剪断, 让血自由滴入盛器。 小鼠可采用约 0.8~1.2ml;大鼠约 5-10ml。 (5)家兔耳缘静脉采血法 (6)心脏采血法 2.动物尿液采集 代谢笼法:此法较常用,适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便 时, 可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开, 达到采集尿液的目的。 由于大、小鼠尿量较少,操作中的损失和蒸发,各鼠膀胱排空不一致等原因,都可 造成较大的误差,因此一般需收集 5 小时以上的尿液,最后取平均值。 反射排尿法:适用于小鼠,因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故 需采取少量尿液时,可提起小鼠,将排出的尿液接到带刻度的容器内。 导尿法:常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后,固定于手术台上。由尿道插入 导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹),可以采到没有受到污染的尿液。 (九)实验动物的处死及解剖 1.脊椎脱臼法:多用于小鼠; 右手抓住鼠用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头,将脊髓与脑 髓拉断,鼠便立即死亡 2.断头法:大小鼠; 实验者戴上棉绿纱手套,用右手握住大鼠头部,左手握住背部,露出颈部,助
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手用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉。小鼠处死法相同。 3.急性大失血法 可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。 4.击打法 右手抓住鼠尾,提起,用力摔击其头部,鼠痉挛后立即死亡。用小木锤用力击 打鼠头部也可致死。 5.麻醉致死法 6.麻醉后急性放血法 7.空气拴塞法 8.化学致死法 吸入一氧化碳,大、小鼠在一氧化碳浓度为 0.2-0.5%环境中即可致死。 皮下注射士的年,吸入乙醚、氨仿,均可致死。士的年注射量,小鼠为 0.76~ 2.0mg/kg 体重,大鼠 3.0-3.5ml/kg 体重。氯化钾处死大鼠剂量:25%溶液 0.6ml/只静 脉注入。 9.开放性气胸法 作业 1. 将 60 只小鼠按体重随机分成 6 组,写出计算过程和分组结果。 2. 画出自己所领取实验动物的标号示意图。

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实验二 急性经口毒性实验 一、实验目的: (一)通过本次实验掌握经口灌胃技术,半数致死剂量的意义。 (二)通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。 二、实验器材及试剂 1、器材 帆布手套、橡胶手套、剪刀、大头针、小鼠鼠笼、泡沫塑料板、棉签、纱布、 脱脂棉、小鼠灌胃针、1ml 注射器等 2、试剂 (1)甲醇,梯度稀释,浓度分别为 75.0%、60.0%、48.0%、38.4%、30.7% 和 24.% 三、测定方法: 本实验以灌胃方式测定甲醇的半数致死量(LD50) 。 (一)实验动物与分组: 首选健康成年昆明种小鼠 (8 周龄,18g~25g)或大鼠(180g~220g) 。 实验前动物要在实验环境中适应 3~5 d 时间,以了解其正常活动情况和健康状 况,并淘汰不健康或体重不符合要求的动物 。 本次实验取体重 18-25 g 的小鼠,实验时,将小鼠称体重、编号、按随机分组 原则,将实验动物分成 5 组,每组 8 只。 (二)剂量选择: 首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的化学物的 LD50, 以此值作为受试 化学物的预期毒性中值,即中间剂量组,再上下各推 1-2 个剂量组,进行预实 验。查阅文献得知对于小鼠甲醇的 LD50 约为 7200mg/kg BW。但对于人,甲醇摄 入量超过 4 克就会出现中毒反应,误服一小杯超过 10 克就能造成双目失明,饮 入量大造成死亡。致死量为 30 毫升以上,甲醇在体内不易排出, 会发生蓄积, 在体内氧化生成甲醛和甲酸也都有毒性。 各剂量组的间距可根据 LD50 计算方法要求按等比级数或等差级数安排。 本实验用机率单位法计算 LD50,要求按等比级数排列,常用 1:0.8,如甲醇的最 高剂量为 12000 mg/kg,其次剂量组为 12000 mg/kg *0.8=9600 mg/kg ,依次类 推为 7680、6144、4915.2 和 3932.2 mg/kg 六个剂量组。 (三)受试化学物配制与稀释 1. 溶剂: 水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液。 脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油等配制。 (三)受试化学物配制与稀释 2. 受试物的稀释 等容量稀释法, 各个剂量组的动物均给予相同单位体重体积的受试化学物, 按照 事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。 例如本次实验五个剂量组: 各剂量组动物给予相同单位体重体积受试物均为 20ml/kg。 等容量稀释法 D:设计的染毒剂量, mg/kg
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V:动物给药量(相同单位体重体积)均为 20ml/kg X:各组需配制的受试物溶液的浓度(mg/ml) 如:第一组染毒剂量 D=12000 mg/kg,动物按 V= 0.2 ml/10 g(20 ml/kg)体重给 药,配制的受试物浓度为 X=600 mg/ml 依次类推:计算六个染毒动物组所需配制的受试物浓度 第一组:600 mg/ml;第二组:480 mg/ml;第三组:384 mg/ml 第四组:307.2 mg/ml;第五组:245.8 mg/ml;第六组:196.6 mg/ml 根据以下公式计算各剂量组小鼠灌胃容量: 小鼠灌胃容量 V ml=体重(g)×20ml/1000g 各剂量组小鼠染毒剂量(甲醇密度 ρ=0.8g/ml): 小鼠染毒剂量= V ×各组的受试物浓度(mg/10ml) (四)灌胃方法: 小鼠灌胃法: 左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤, 无名指或小指将尾部紧 压在手上,使小鼠腹部向上,尽量使其体位垂直,注意使动物的上消化道固定成 一直线。右手持连着灌胃导针的注射器,将灌胃针由动物口腔侧插入,避牙齿, 沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力,可轻轻上下滑动探索,一旦感觉阻力消失, 即深人至胃部,一般进针深度小鼠 2.5~4cm,随后将受试物溶液注入。如遇动 物挣扎,应停止进针或将针拔出,千万不能强行插入,以免穿破食管,甚至误入 气管,导致动物立即死亡。小鼠一次灌胃体积为 10-20ml/kg (五)中毒体征和死亡情况观察 染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。 高剂量组动物的死亡常很快发生,染毒后应即刻密切观察。 根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。 观察的项目包括: (1)中枢神经系统和神经肌肉系统:体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、 抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝; (2)植物神经系统:瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪; (3)呼吸系统:鼻孔流液、鼻翼煽动、血性分泌物、呼吸深缓、呼吸过速、仰 头呼吸、 ; (4)泌尿生殖系统:会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀; (5)皮肤和毛:皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽; (6)眼:眼球突出、结膜充血、角膜浑浊、血性分泌物; (7)消化系统:腹泻、厌食。 三、LD50 计算: 可采用多种方法测定 LD50,有机率单位法、霍恩氏法、寇氏法等,机率单位法 等。由于寇氏法较常用,并有计算简便,结果较准确等特点,故推荐使用。 1 预备实验 ( 1 )摸索上下限:即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量( D m ) 和一个动物也不死亡的最大剂量( D n ) 。 方法是据经验或文献定出一个估计量,观察 2~3 只动物的死亡情况。如全死,则降 低剂量;如全不死,则加大剂量再行摸索, 直到找出 P m =100% 和 P n =0% 的剂量,此两量分别为上下限。 ( 2 )确定组数,组距及各组剂量 ①组数:一般 5 ~ 8 组,可根据适宜的组距确定组数,如先确定 5 组,若组距过
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大,可再增加组数以缩小组距。 有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。 ②组距:指相邻两组剂量对数之差,常用“ d ”来表示。 D 不宜过大,因过大可 使标准误增大;也不宜过小,因过小则组数增多, 各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素 的敏感性。敏感性大者,死亡率随剂量增加(或减少) 而增加(或减少)的幅度大,组距可小些;反之,敏感性小者,死亡率随剂量变化 的幅度小,则组距应大些。上下限之间的距离可作为 敏感性大小的标志。 距离大, 说明敏感性小;距离小,则说明敏感性大。一般要求 d 应小于 0.155 ,多在 0.08 ~ 0.1 之间。 ③确定组距方法:把上下限的剂量换算成对数值,设上限剂量的对数值为 X k ,下 限剂量的对数值为 X 1 ,组数为 G ,则: d =( X k -X 1 ) / ( G-1 ) ④确定各组剂量:由 X 1 逐次加 d (或由 X k 逐次减 d ) ,得出各组剂量的对数 值,再分别查反对数, 即得出各组剂量(呈等比级数排列) 。 ( 3 )配制等比药液,并使每只动物在给药容量上相等(如 0.5ml/20g ) 。 ⒉正式实验 ( 1 )实验动物的选择与分组 ①选择原则:可根据不同实验而选取动物,应选择对被试因素敏感的动物。同时也 应考虑动物来源,经济价值及操作简便等条件。 LD 50 常用小白鼠进行实验来测得。 ②分组原则:每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数,就不能充分 反映各组死亡率的差别。 (如共 8 组, 每组 10 只动物, 高剂量三个组的死亡数分别为 6 、 9 、 10 , 但如果每组只用 6 只动物,则高剂量三个组的死亡数可能都是 6 。 ) ③分组方法:见附录,实验对象分组法。首先,按性别将动物雌雄分开或各半混合 编组,然后按体重分群,再随机分组, 为求使各组平均体重相等。 ( 2 )给药、观察死亡数、求出死亡率 ①给药途径:可据不同药物及动物而定,小白鼠多用腹腔注射或灌胃法;也可静脉 注射。 ②给药顺序:宜采取间隔跳组方法。如共 7 组,先按 2 、 4 、 6 组顺序给药, 然后逆行按 7 、 5 、 3 、 1 组的顺序给药。 这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。 而且当第 3 组给药后, 如 第 2 组动物已经全死,则可省下第 1 组动物及 1 号药液。如第 7 组已死亡,可补做第 8 组,争取做出 0 ﹪死亡率的组来。每只 动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。 ③观察时间:直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、 温度等生活条件,严防非被试因素引起的死亡。 最后将死亡情况及各种数据填入表中,计算 LD50 和 95%置信区间。 四、结果评价: 根据实验动物中毒体征、死亡时间、根据得出的 LD50 及受试物的种类,按相应的国 家标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准(农药的急性毒性分级)对受试物进
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行毒性定级,判断受试物的毒性大小。 五、注意事项: 1.灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管 2.正确捉拿动物,防止被咬伤且避免动物损伤 3.灌入量计算和操作要准确,否则影响结果 4.防止操作者中毒。注意通风,不要把药品撒到手、脸部皮肤及身体其他部位, 操作过程中要小心。 六、实验报告应包括以下内容: 1.实验动物的种属。 2.实验动物体重和随机分组情况。 3.受试物的名称、性状等情况。 4.受试物的配制和溶剂。 5.描述实验观察的中毒表现和死亡情况等。 6.LD50 的计算方法和结果。 7.受试物的急性毒性分级、分级依据和结果评价。

例:解磷定半数致死量(LD50)的测定 1.预试验 取小鼠 12 只,随机分为 4 组,按表 1 剂量腹腔注射解磷定溶液,

组间剂量之比为 2:1,记录给药 2 小时内各组死亡率,求出 0%和 100%死亡率的剂 量范围。 表 1 求解磷定 LD50 的预试结果 组别 小鼠(只) 1 2 3 4 3 3 3 3 2.正式实验 浓度 剂量 给药容量 死亡动物(只) 死亡率

(mg/ml) (mg/kg) (ml/10g) 15 7.5 3.75 1.88 300 150 75 35.5 0.2 0.2 0.2 0.2

取体重 18~22g 小鼠 50 只,按体重随机分为 5 组,每组 10 只,

最好雌雄各半,各组按表 2 剂量腹腔注射解磷定溶液,组间剂量之比为 10:8,给药 后观察动物中毒症状,记录给药后 2 小时内各组死亡率。
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表 2 求解磷定 LD50 的结果 组别 1 2 3 4 5 3 .计算方式 小鼠 剂量 对数剂量 2.48 2.38 2.28 2.18 2.08 死亡动物 (只) 死亡率

(只) (mg/kg) 10 10 10 10 10 300 240 192 154 123

根据正式实验各组死亡率按下列公式求出解磷定腹腔注射的

LD50 和可信限(P=0.95)。 (1)当最小剂量组的死亡率为 0%,最大剂量组的死亡率为 100%时,可按下列 公式计算 LD50:

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]
(2)当最小剂量组的死亡率大于 0%而又小于 30%, 或最大剂量组的死亡率小于 100%而又大于 70%时,可按下列校正公式计算 LD50:

LD50=lg-1[Xm-i(∑p- LD50 的标准误:Sx50=i

3-Pm-Pn )] 4

P-P2 n-1

LD50 的平均可信限:LD50±4.5 Sx50 LD50(P=0.95) 。 上式中, Xm 为最大剂量组剂量的对数, i 为相邻两组对数剂量之差值(大剂量组减小 剂量组),Pm 为最大剂量组死亡率,Pn 为最小剂量组死亡率,P 为各组死亡率,n 为每组动物数。

作业 1、记录注射不同剂量甲醇后小鼠的急性毒性表现,汇总后计算 LD50 及其 95% 可信限。 2、将某种中药制剂给小白鼠灌胃后,48 小时内各剂量组的死亡数如下,求该药 的 LD50 及其 95%可信限。 灌胃剂量(g/kg): 5.12 6.40 8.00 10.0 12.5 死亡数/实验动物数: 1/10 2/10 4/10 7/10 9/10

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实验三

小鼠骨髓多染红细胞微核试验

目的和意义 微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损 伤,以确定该受试物有无诱变性。通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细 胞微核测定方法。 原理 正常细胞的有丝分裂的分裂中期,染色体均匀地排列在赤道板附近,到分裂后 期便分成两份,分别向两极移动,并在末期分别形成两个子细胞的核。如果由于某 种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤,在中期就会观察到染色体断 裂, 在进入分裂后期时, 这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近, 当其它染色体分别形成子细胞核时,这些落后的断片便独立形成微核,如果纺锤体 功能受损,也可产生微核。 由上可见,微核的出现和染色体畸变有密切相关性,同时微核的观察是在细胞 的间期,不必分析中期相,这比分析染色体畸变要方便一些。进行骨髓细胞微核分 析一般观察红细胞,记数嗜多染红细脑中微核出现率。 器材与试剂 1、器材 载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片 架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜(或荧光显微 镜) 。 2、试剂 小牛血清; 甲醇; 吉姆萨储备液:将 1g 吉姆萨倒入研钵内,加入少许甘油混合研细,分次倒入 剩余的甘油至 66ml,转移到烧杯内(或试剂瓶内) 。放入 55~60℃水浴中并不断搅 动至 2h。取出冷却后加入 60ml 甲醇,混匀后置室温,2~3 周后过滤,保存于棕色 瓶内备用(存放时间越长染色效果越好) 。 吉姆萨染色液:实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液(pH 6.8)1 : 9 混匀。 磷酸盐缓冲液(pH 6.8) 阳性对照物:环磷酰胺。 操作步骤 一、试验动物及处理 1、动物的选择:选用小鼠,每组 10 只动物,雌雄各半。小鼠体重在 18~20g, 7~12w。 2、染毒途径:采用腹腔注射给药。 3、剂量选择:环磷酰胺按 50mg/kg 剂量染毒,同时设立阴性对照(空白对照) 。 4、染毒次数和取样时间:采用 30h 给药法,即两次给药间隔 24h,在第二次给 药后 6h 处死动物采集骨髓。 二、骨髓液的制备和涂片
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脱颈椎处死小鼠,立即取出胸骨,除去胸骨上的血液和肌肉,横向切断胸骨, 暴露骨髓腔挤出骨髓,小心地涂布于载玻片一端的胎牛血清液滴里,混匀涂片。 三、固定 骨髓涂片于空气中晾干后,放入甲醇中固定 15 分钟,取出自然晾干。 四、染色 固定晾干的玻片在吉姆萨染色液中染色 10?15 分钟, 然后冲洗掉玻片上的染液, 自然晾干。 五、镜检 先在低倍镜下观察,选择分布均匀,染色较好的视野,然后换到油镜下观察计 数。成熟的红细胞呈桔黄色,而嗜多染红细胞呈灰蓝色。微核大多数呈圆形或椭圆 形、单个或多个、边缘光滑整齐,染色与核一致,呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内 可出现一个或多个微核。计数 1000 个 PCE 中含微核的 PCE 数,并且计数 200 个细 胞中 PCE 与 NCE 的比值。 六、结果分析与评价 微核率以千分率表示。 每只动物为一观察单位, 每组动物计算微核 PCE 均值的。 正常的 PCE/NCE 约为 1(0.6~1.2) ,如比值<0.1,表示 PCE 形成受到严重抑制,受 试化学物的剂量过大,试验结果不可靠。

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实验四 小鼠精子畸形试验
1 实验目的 掌握小鼠精子畸形试验的基本技术要求。 学会评价化学物对雄性生殖细胞的遗传毒性。 2 原理 小鼠精子畸形受基因控制,具有高度遗传性,许多常染色体及 X、Y 性染色体基因 直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常,已知精子的畸形是 决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产 物的改变。小鼠精子畸形试验可检测环境因子对精子生成、发育的影响,而且对已 知的生殖细胞致突变物有高度敏感性,故本试验可用作检测环境因子在体内对生殖 细胞的致突变作用。 3 仪器与试剂 3.1 实验室常用设备。 3.2 生物显微镜、染色缸。 3.3 甲醇。 3.4 1%~2% 伊红染色液:称取伊红 1~2 g,溶于 100mL 蒸馏水备用。 全部试剂除注明外,均为分析纯,试验用水为蒸馏水。 4 实验动物 成年雄性小鼠,6~8 周龄、体重 25~35 g。动物购买后适应环境 3-5 天。 5 剂量及分组 受试物应设三个剂量组, 最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物 出现死亡的剂量,一般可取 1/2 LD50,低剂量组应不表现出毒性,分别取 1/4 和 1/8 LD50 作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌 胃容量)动物无死亡而求不出 LD50 时,高剂量组则以以下顺序(1)10g/kgBW; (2) 人的可能摄入量的 100 倍;或(3)一次最大灌胃剂量进行设计,再下设中、低剂量 组。另设溶剂对照组和阳性对照组。每组至少有 5 只存活动物。阳性物可采用环磷 酰胺 40~60 mg/kgBW、甲基磺酸甲酯(MMS)50 mg/kgBW 或丝裂霉素 C(MMC) 1.0~1.5 mg/kgBW 经口或腹腔注射(首选经口)给予。 6 操作步骤 6.1 受试物配制 一般用蒸馏水作溶剂,如受试物不溶于水,可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素 等配成乳化液或悬浮液。受试物应于灌胃前新鲜配制,除非有资料表明以溶液(或 悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。 6.2 实验动物的处理 经口给予,连续 5 天 。各种致突变物作用于精子的不同发育阶段,可在接触某种致 突变物后不同时间出现精子畸形,故有条件时,可于给受试物后第 1、4、10 周处死 动物,检查精子形态。因为大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母细胞早 期的生殖细胞较为敏感,故一般均是于首次给受试物后的第 35 天处死。
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6.3 标本制备 用颈椎脱臼法处死小鼠,取出两侧副睾,放入有适量生理盐水(约 1 mL)的小烧杯 中或放入盛有 2mL 生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪 1~2 刀,静止 3~ 5min ,轻轻摇动。用四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤,吸滤液涂片。空气干燥 后,待涂片干燥后,放入甲醇(A.R)液中固定 5min。取出晾干。用 1%~2%伊红 染色 1h,用水轻冲,干燥。 6.4 阅片 6.4.1 阅片要求 在低倍镜下(用绿色滤光片)找到背景清晰、精子重叠较少的部位,用高倍镜顺序 检查精子形态,计数结构完整精子。精子有头无尾(轮廓不清)或头部与其它精子 或碎片重叠,或明显是人为剪碎者,均不计算,每只动物至少检查 1000 个精子。 6.4.2 精子畸形的类型 精子畸形,主要表现在头部,其次为尾部。畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、 无定形、尾折叠、双头、双尾等。 6.4.3 阅片注意事项 异常精子均应记录显微镜的坐标数,以备复查。并分别记录异常类型,以便统计精 子畸形率及精子畸形类型的构成比。判断双头、双尾畸形时,要注意与二条精子的 部分重叠相鉴别,判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。 7 数据处理 每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行比较,如用 Wilcoson 秩和检验法评价 精子畸形阳性的标准是,畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义,并 有剂量反应关系。 8. 结果判定 一般阴性对照组的精子异常率为 0.8%~3.4%,供参考。但应有本实验室所用实验 动物的自发畸形率作参考。 作业 观察并记录各组小鼠精子畸形情况

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