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第18章 高效液相色谱法

第18章  高效液相色谱法


第十八章

高效液相色谱法 high performance liquid chromatography;HPLC

基本要求
掌握:反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要

影响因素和分离条件选择;化学键合相的性质、特点和
种类及使用注意事项;流动相对色谱分离的影响;HPLC 中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用;定量分 析方法。 熟悉:反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条 件的选择;高效液相色谱仪的部件;紫外检测器和荧光 检测器的检测原理和适用范围。 了解:离子、手性和亲合三种色谱法;溶剂强度和选择 性;混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法。
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基本内容
§18.1 高效液相色谱法的主要类型和原理 §18.2 高效液相色谱法的固定相和流动 相及其选择 §18.3 高效液相色谱仪 §18.4 高效液相色谱分析方法

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高效液相色谱法

?流动相为液体,采用高效固定相,以高压 输送流动相的色谱法。 ?引入气相色谱的塔板理论和速率理论及先 进的实验技术和方法,通过改进固定相达 到了高效,采用高压输送流动相,达到了 高速。 ?特点:分离效能高、分析速度快及仪器化

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高效液相色谱法与经典液相色谱法对比
经典液相色谱法 固定相 固定相粒度(μm) 固定相粒度分布(RSD) 柱长(cm) 柱内径(cm) 柱入口压强(kg/cm2) 柱效(每米理论塔片数) 样品用量(g) 分析所需时间(h) 一般规格 75~500 20~30% 10~100 2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 高效液相色谱法 (分析型) 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5

装置
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非仪器化
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仪器化

高效液相色谱法与气相色谱法对比
气相色谱(GC) 应用范围 分离效果 占有机物的20% 高 流动相是气体,只能 选择固定相 高温 10-12 高效液相色谱(HPLC) 占有机物的80% 更高

选择性
温 度 灵敏度(g/ml)

流动相是液体,流动相、 固定相都可选择。选择 性广。 常温(分离效果好) 10-9

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第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理

一、基本类型
吸附色谱法( adsorption chromatography LSC)
分配色谱法( partition chromatography LLC) 离子交换色谱( ion exchange chromatography IEC) 空间排阻色谱(steric exclusion chromatography SEC)

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主要类型
化学键合相色谱法﹡(bonded phase chromatography BPC)
流动相极 适于分离物 离子对色谱法(paired ion chromatography PIC) 分类 固定相 流动相 组分流出顺序 性增大 tR 变小 质 正相色谱 离子抑制色谱法(ion suppression chromatography ISC) YWG-CN 分析极性大 (NP) (NH2) 有机溶剂 极性小的先流出 物质、糖类 非极性~中 等极性组分 ( 用 于 HPLC 80%)

亲合色谱法(affinity chromatography AC)
tR 手性色谱法(chiral chromatography CC) 变大 反相色谱 (RP) YWG-C18 (ODS) 甲醇-水、 极性大的先流出 乙腈-水

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疏溶剂理论
缔 和

解缔和

疏溶剂缔合作用示意图
l.键合烃基
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2.溶剂膜

3.溶质的极性部分

4.溶质的非极性部分
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3.反相离子抑制色谱和反相离子对色谱
(1)反相离子抑制色谱 ? 离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质
pH一定的缓冲溶液

? 酸性物质——加入酸,如HAc,tR↑,K↑ 碱性物质——加入碱,如NH3· 2O,tR↑,K↑ H ?调节pH范围:2.0~8.0 适用: pH=3~7弱酸;pH=7~8弱碱;两性化合物
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(2) 反相离子对色谱法
离子对试剂 种类及浓度: pH: 适用:

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(2) 反相离子对色谱法

离子对试剂种类及浓度: pH:
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适用:

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第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择

一、化学键合相色谱的固定相 (1)液-固吸附色谱法(LSC) 固定相常用硅胶、高分子多孔微球
硅胶 表孔硅胶(YBK) 特点 易装柱,柱效不高,柱容量小(η :1000~5000)

无定形全多孔硅胶(YWG) 柱效高,柱容量大,价廉,但要匀浆( :8000~10000) (η 球形全多孔硅胶(YQG) 堆积硅珠 具YWG的优点,且涡流扩散项小,渗透性好 传质阻抗小,柱容量大(η >800000)

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第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择

一、化学键合相色谱的固定相

键合量评价:?含碳量 ?覆盖度 ?封尾 硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 优点:固定液不易流失,稳定(在pH2~8范围) 1-尿嘧啶;2-苯酚;3-乙酰苯;4-硝基苯;5-苯甲酸甲酯;6-甲苯 ,热稳定性好,且能用于梯度洗脱。
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二、化学键合相色谱法的流动相
要求:

①与固定液不反应
②对样品有良好溶解度 k=1~10 最佳k=2~5

③与检测器匹配
④粘度小、纯度高。

⑤流动相使用前需用微孔滤膜滤过、脱气。
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(一)流动相对分离的影响

n α -1 k2 R? ? ? 4 α 1 ? k2
由填 固充 定质 相量 及决 色定 谱
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受 受 溶 溶 剂 剂 种 配 类 比 (选择性) (强度) 影 影 响 响
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(二)溶剂的强度和选择性
? 1.溶剂的极性和强度 ? 斯奈德(Snyder)溶剂极性参数(polarity parameter)

p ' ? lg( k"g )乙醇 ? lg( k"g )二氧六环 ? lg( k"g )硝基甲烷
? 正相色谱 溶剂极性越强,洗脱能力越强,是强溶剂。

? 反相色谱 溶剂极性越弱,洗脱能力越强,是强溶剂。
强度因子S

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正相色谱 极性参数P′

反相色谱 强度因子S
反相色谱常用溶剂的强度因子
水 0
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甲醇 3.0

乙腈 3.2

丙酮 3.4
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二恶烷 3.5

乙醇 3.6

异丙醇 4.2

四氢呋喃 4.5

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2. 混合溶剂的强度
正相键合相色谱法
n

' P混 ? ? Pi'?i i ?1

式中 Pi ' 和 ?i 为纯溶剂 i 的极性参数及该溶 剂在混合溶剂中的体积分数。 反相键合相色谱法

S混 ? ? Si?i
i ?1

n

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3.溶剂的选择性 原则:控制k=2~5 依据:溶剂和溶质间的作用力---选择性参数
Xe=lg(K〞g)e/Pˊ, Xd=lg(K〞g)d/Pˊ, Xn= lg(K〞g)n/Pˊ

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(三)流动相最优化方法

四面体法

S A ? S H 2 0 ? ? H 2 0 ? SCH 3OH ? ?CH 3OH

(a)四面体内的等洗脱面ΔABC

(b)等洗脱面中10个初试实验 溶 剂的配比(A/B/C)

? ? 3.0 ? 0.4 ? 1.2 ? 0处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同,在色谱分离中具有 ?THF ? S B 相似的选择性,而处于不同组别的溶剂,其选择性差别较大。 ? S A ? S H 2O? H 2O ? SCH 3CN ?CH 3CN

?CH CN ? 1.2 / 3.2 ? 0.375
3 ?上一内容

1.2 / 4.5 ? 0.267

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三、分离条件选择
(一)HPLC中的速率理论(与GC对比) ? GC: H=A+B/u+C· (填充柱) u ? 或 H=B/u+C· u (毛细管柱)
? HPLC:

H=A+C· u
? B ? 2? ? Dm
Dm ? T

?

柱温T ? ,流动相? ? 大 ? B相忽略
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讨论
1)流动相流速对HPLC板高的影响

u ? 1ml / min 时,H ? u u ?? H ? ,n ?? 柱效 ? ,但t R ?

? 兼顾柱效和分析时间, 选择u ? 1ml / min
2)涡流扩散项及其影响因素

A ? 2? ? dp
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A ? ? ? dp
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? ? ,dp ?? A ?? H ? ,n ?? 柱效 ?
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3)传质阻抗项及其影响因素

C ? C m ? C sm ? C s ? C m ? C sm
注:只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗,忽略 固定相的传质阻抗

? HPLC:H ? A ? C m ? u ? C sm ? u
Cm ? Csm ?

?d p 2
Dm

C?

dp

2

ωm:色谱柱及填充情况决定的因子

Dm

Dm ?

T

?

dp ?? C ?? H ? , n ?? 柱效 ?

? ?? Dm ?? H ? , n ?? 柱效 ?
T ?? Dm ?? C ? , 但易产生气泡 T ?? Dm ?? ? ? , 柱阻 ?
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涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响

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HPLC法的分离条件
(1) 固定相的选择:小粒度、分布均匀的球形化学键合 相固定相(dp≤10μm)

(2) 流动相及其流速的选择:选粘度小、低流速
(1ml/min) 的流动相——甲醇或乙腈 (3) 柱温的选择:一般选室温250C左右 (4) 洗脱方式:等度洗脱(恒组成溶剂洗脱) 梯度洗脱

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第三节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1.贮液罐(滤棒,可滤去颗粒状物质) 2.高压泵(输液泵) 3.进样装置 4.色谱柱——分离 5.检测器——分析 6.废液出口或组分收集器 7.记录装置

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1.输液泵:柱塞往复泵

特点:具有压力平稳、脉冲小、 压力:20~50MPa。 流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 ?返回 ?上一内容 ?下一内容 ?回主目录

1.输液泵:柱塞往复泵

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?洗脱方式 1. 等度洗脱
2. 梯度洗脱

梯度洗脱的优点:①缩短分析周期;②提高分离 效果;③改善峰形,很少拖尾;④增加检测灵敏度 (因峰变瘦、变高)。但有时引起基线漂移及重复

性不佳是其缺点。
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两种实现梯度洗脱的装置:高压梯度和低压梯度

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二、进样系统和色谱柱
(一)进样器 流路中为高压力工作状态,

通常使用耐高压的六通阀进样装置,
其结构如图所示:

load
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injection
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(二) 色谱柱
柱体为直型不锈钢管,内径1~6 mm,柱长5~40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

(4.0 mm×250 mm,5 μm),
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三、检测器

(一)光电二极管阵列检测器(PDAD)

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二、蒸发光散射检测器(ELSD)

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第四节 高效液相色谱分析方法

? 定性分析方法 ? 定量分析方法: 外标法、内标法 同GC

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? 作业:3,13,19

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三、分离条件选择(自学)
(一)HPLC中的速率理论(与GC对比) ? GC: H=A+B/u+C· u (填充柱) ? 或 H=B/u+C· u (毛细管柱)
? HPLC: H=A+C· u
? B ? 2? ? Dm
Dm ? T

?

柱温T ? ,流动相? ? 大 ? B相忽略
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讨论
1)流动相流速对HPLC板高的影

u ? 1ml / min 时,H ? u u ?? H ? ,n ?? 柱效 ? ,但t R ?

? 兼顾柱效和分析时间, 选择u ? 1ml / min
2)涡流扩散项及其影响因素

A ? 2? ? dp
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A ? ? ? dp
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? ? ,dp ?? A ?? H ? ,n ?? 柱效 ?
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3)传质阻抗项及其影响因素

C ? C m ? C sm ? C s ? C m ? C sm
注:只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗,忽略 固定相的传质阻抗

? HPLC:H ? A ? C m ? u ? C sm ? u
Cm ? Csm ?

?d p 2
Dm

C?

dp

2

ωm:色谱柱及填充情况决定的因子

Dm

Dm ?

T

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dp ?? C ?? H ? , n ?? 柱效 ?

? ?? Dm ?? H ? , n ?? 柱效 ?
T ?? Dm ?? C ? , 但易产生气泡 T ?? Dm ?? ? ? , 柱阻 ?
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涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响

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HPLC法的分离条件
(1) 固定相的选择:小粒度、分布均匀的球形化学键合 相固定相(dp≤10μm)

(2) 流动相及其流速的选择:选粘度小、低流速
(1ml/min) 的流动相——甲醇或乙腈 (3) 柱温的选择:一般选室温250C左右 (4) 洗脱方式:等度洗脱(恒组成溶剂洗脱) 梯度洗脱

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