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分子发光分析法_图文

分子发光分析法_图文

第五章

分子发光分析法

第五章
?

分子发光分析法

分子荧光、磷光分析法的基本原理
介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光 强度与被测物质之间的关系

?
? ?

荧光分析仪器 分子荧光定量分析 简介化学发光

§ 5- 1

概述

一、分子发光分析法及其分类 ? 某些物质的分子吸收一定能量后,电子从基态跃 迁到激发态,以光辐射的形式从激发态回到基态, 这种现象称为分子发光,在此基础上建立起来的 分析方法为分子发光分析法
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激

分子在退激过程中以光辐射形式释放能量

?

根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分 为以下几类:
荧光—荧光分析法

光致发光:以光源来激发而发光

磷光—磷光分析法

电致发光:以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光:以生物体释放的能量激发而发光 化学发光:以化学反应能激发而发光—化学发光分析


二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 ? 荧光强度随激发光强度增强而增强(提高激发光 强度,可提高荧光强度
激发光
强 发射荧光 强 激发

物质

采用高灵敏度的检测系统可大大提高 灵敏度,检测限荧光分析法比分光光度法 低2~4个数量级

2. 选择性好
?

不同的物质用不同的光进行激发,选择不同的激发 光波长

?

不同的物质发射的荧光不同,选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰,选择性好

?

3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少;仪器价格适中;测定范围较广
?

具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物, 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛,不如分光光度法

?

§ 5- 2

荧光和磷光光谱法

一、荧光和磷光光谱的产生 ? 具有不饱和基团的基态分子光照后,价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 ?* ? ? ?* ?n

基 态 在光致激发和去激发光的过程中,分子中 的价电子( ?、n电子)处于不同的自旋状 态,通常用电子自旋状态的多重性来描述
?

1. 电子自旋状态的多重性
?

大多数分子含有偶数电子,基态分子每一个轨道 中两个电子自旋方向总是相反的?? ,处于基态单 重态。用 “S0” 表示 ;当物质受光照射时,基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁,由基态跃迁至 更高的单重态,电子自旋方向没有改变,净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
基态单重态 S0

S0, S1, S2, S3分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态

单重态分子具有抗磁性,激发态的平均寿命约为10-8

?

若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变, 由基态单重态→激发三重态,净自旋 ? 0。这种跃 迁为禁阻跃迁
第一激发三重态 T1 基态单重态 S0

自旋平行

T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态
三重态分子具有顺磁性,激发态的平均寿命约为 10-4~1S

分子中电子受激跃迁到激发态后,处于激发态的分 子是不稳定的,去激返回到较低激发态或基态时有 两种方式:无辐射去激和辐射去激 2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去 激,体系内的多余的能量以热的形式释放。包括: ? 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S ? 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换 S-T ? 振动驰豫(VR)—同一电子能级中,从较高振动 能级到较低振动能级的过程 ? 外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用及能量转移,使荧光或磷光强度减弱或消 灭 ? 发生系间窜跃电子需转向,S1—T1间进行,比内部 转换困难
?

VR
S2 IC VR S1 ISC

VR:振动驰豫 IC:内部转换 ISC:系间窜跃

T1

S0 吸光 吸光

S0

3. 荧光和磷光光谱的产生—辐射去激
?

处于S1或T1态的电子返回S0态时,伴随有发光现 象,这种过程叫辐射去激 发光 S1或T1 S0 (1)荧光: 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光
?

荧光是相同多重态间的允许跃迁,产生速度快, 10-9~10-6s,又叫快速荧光或瞬时荧光,外部光源停 止照射,荧光马上熄灭
?

无论开始电子被激发至什么高能级,它都经过无辐 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级,发射荧光, 荧光波长比激发光波长长。 ? 荧>?激
?

VR
S2 IC VR S1 ISC

VR:振动驰豫 IC:内部转换 ISC:系间窜跃

T1

S0 吸光 吸光 荧光

S0

图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图

(2)磷光
?

当受激电子降到S1的最低振动能级后,未发射荧

?

?

?

光,而是经过系间窜跃到T1振动能级,经振动驰 豫到 T1最低振动能级,从T1最低振动能级回到基 态的各个振动能级所发射的光叫磷光 从T1 ? S1要改变电子自旋,发光速度慢,约为 10-4 ~ 10s,光照停止后,磷光仍可持续一段时间 分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大,所以磷光的 波长更长 ? 磷 > ? 荧> ?激 ? ? ?* 易产生荧光 n ? ?* 易产生磷光

VR
S2 IC VR S1 ISC

VR:振动驰豫 IC:内部转换 ISC:系间窜跃

VR
T1

S0 吸光 吸光 荧光 磷光

S0

图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图

二、荧光、磷光与分子结构的关系
?

了解荧光与分子结构的关系,可以预测哪些物质能产 生荧光,在什么条件下产生,以及发射的荧光有什么 特征以便更好地运用荧光分析技术,采取一些措施把 不发荧光的物质产生荧光,即把非荧光体变成荧光体, 弱荧光体变成强荧光体 (一)荧光效率 ? 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述

荧光量子效率 ?f =

发荧光的分子数

激发态分子总数

? f 是一个物质荧光特性的重要参数,反映了荧光物 质发射荧光的能力, ? f 越大,荧光越强,在0~1之 间

?

若以各种跃迁速率常数来表示

?f ?
?

Kf K f ? ? Ki

?

?

Kf 为荧光发射过程的速率常数——取决于 物质的化学结构 ∑Ki 为非辐射跃迁的速率常数之和——主要 取决于化学环境,也与化学结构有关 分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效 率在0.1~1之间

?

?

至今对激发态分子的性质了解不深,无法定量地描 述荧光与分子结构之间的关系 一般情况,有机芳香族化合物及金属离子配合物是 最强最有用的荧光体

(二)荧光磷光与有机化合物结构的关系
?

?

?

物质只有吸收了紫外可见光,产生? ? ?*n ? ?*跃 迁,产生荧光 ? ? ?*与n ? ?*跃迁相比,摩尔吸收系数大102~103, 寿命短 ? ? ?*跃迁常产生较强的荧光, n ? ?*跃迁产生的 荧光弱,但可产生系间窜跃,产生更强的磷光

1. 共轭体系——有较强的荧光 ? 具有共轭体系的芳环或杂环化合物, ?电子共轭 程度越大,越易产生荧光; 环越多,共轭程度越 大,产生荧光波长越长,发射的荧光强度越强
?f 苯 萘 蒽 0.11 0.29 0.46 ? ex /nm 205 286 365 ?em /nm 278 310 400



线状环结构比非线状 结构的荧光波长长

350

? 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系, 多数能发生荧光

? 多环芳烃是重要的环境污染物,可用荧光 法测定
? 3,4 - 苯并芘是强致癌物

? ex = 386 nm ?em = 430 nm

2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构
?

具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
-o

o

o

-o

o coo -

coo 荧光素:氧桥把两 个环固定在一个平 面上,具有平面结 构,强荧光物质

酚酞:无氧桥把两 个环固定,不能很 好的共平面,为非 荧光物质

例 1,2 - 二苯乙烯
H C=C H

H C=C H

顺式:非平面构型

反式:平面构型

非荧光体

强荧光体

(三)金属螯合物的荧光
?

?

?

大多数无机盐类金属离子,不能产生荧光,但某 些螯合物都能产生很强的荧光,可用于痕量金属 离子的测定 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光,但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型,就会使荧光加强或产 生荧光 例:8-羟基喹啉为弱荧光体,与Mn+— Al3+、Mg2+ 形成螯合物后,能形成刚性结构,荧光加强
OH N
N M OH

(四)取代基的类型

——取代基对荧光物质的荧光特征和 强度也有很大影响。分成三类: (1)增强荧光的取代基 —— 有 -OH、?
?

OR、 -NH2、-NHR、-NR2等给电子基团 由于基团的 n 电子(孤对电子)的电子云与 苯环上的 ? 轨道平行,共享了共轭 ? 电子, 扩大了共轭体系,使荧光波长长移,荧光强 度增强

(2)减弱荧光的取代基 ——-COOH 、 -NO2 、
-COOR 、-NO、-SH 吸电子基团, 使荧光波长短 移,荧光强度减弱 ? 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后,使系间窜跃加强, 磷光增强,荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量 增加而减弱,磷光相应增强,这种效应为重原子 效应。

(3)影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等

三、环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出 不同的荧光性质 一般来说,溶剂的极性增强,荧光波长长移, 荧光强度增大 2. 温度的影响——低温下测定,提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变,而 非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光 物质都随溶液温度升高荧光效率下降,荧光强 度减弱。 温度对磷光影响更大

3. pH的影响
?

?

大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧 光性质受溶液pH的影响很大 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体,具 有各自的荧光效率和荧光波长 例: 苯酚
OH _ OH H+ _ O

离子化后, 荧光消失

pH≈1有 荧光

pH≈13 无荧光

?

但两个苯环相连的化合物,又表现出相反的性质, 分子形式无荧光,离子化后显荧光
OH

_ O

例:?—苯酚 无荧光 有荧光

另外,表面活性剂也会影响荧光强度和特性

四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光,照射到液池内的荧光物质 时,产生荧光,荧光强度If 用仪器测得,在荧光 浓度很稀 (A<0.05)时,荧光物质发射的荧光强度If 与浓度有下面的关系 ? If = ?f Ia= ?f (I0- I ) I 为吸收的辐射强度 a I0 A ? lg I = I010-A I0为入射光强度 I I0 I ? If = ?f (I0- I010-A ) 荧光池 = ?f I0 (1-10-A ) If荧光
?

将上式展开
2

强度

检测器
3

(?2.3 A) (?2.3 A) I f ? ? f I 0 [2.3 A ? ? ? ??] 2! 3!

(?2.3 A) (?2.3 A) I f ? ? f I 0 [2.3 A ? ? ? ??] 2! 3!
2 3

? 当A﹤0.05时,方括号中其它各项与第一项相比可 忽略不计,上式简化 ? If = 2.3 ?f I0A =2.3 ?f I0 ?bc
当A﹤0.05时, If与 ?f 、I0、 ?和c 有关,对一

给定物质,当激发光波长和强度一定时, ?f 、 I0、 ?和b为常数,合并为K

If = KC Ip = KC

定量分析依据

?

荧光强度与物质浓度呈线形关系,If=KC只 有在浓度低时使用,荧光物质测定的是微 量或痕量组分,灵敏度高

?

浓度高时, If与C不呈线形关系,有时C增 大, If反而降低因为公式[ ]中后面影响, 有时发生荧光猝灭效应

?

荧光猝灭
——荧光物质与溶剂或其它物质之间 发生化学反应,或发生碰撞后使荧光强度 下降或荧光效率?f 下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化 物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭—— M +?激 → M* M* + Q → M + Q +热 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物 质的基态分子所吸收,即自吸收现象

? ?

?

?

五、荧光和磷光分析仪器
(一)荧光分析仪器——主要由光源、单色器、 液槽、检测器和显示器组成 I0
光源 第一单色器

I
液池 检测器

? ex
第二单色器

与分光光度计有两点不同
①两个单色器
检测器

? em
放大器及记录器

②检测器与激发光互成直角

1、光源
?

? ?

激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度;适用波长范围宽 荧光计中,常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯

利用汞蒸气放电发光的 光源;常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强

应用最广泛的一种光 源,可发射250~800nm 很强的连续光源

2、单色器
?

?

?

?

荧光计用滤光片作单色器,荧光计只能用于定量 分析,不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器,有 较高的分辨率,能扫描图谱,既可获得激发光谱, 又可获得荧光光谱 第一单色器作用:分离出所需要的激发光,选择 最佳激发波长? ex ,用此激发光激发液池内的荧 光物质 ? ex 第二单色器作用:滤掉一些杂散光和杂质所发射 的干扰光,用来选择测定用的荧光波长? em。 在 选定的? em 下测定荧光强度,定量分析

3、样品池 ? 盛放测定溶液,通常是石英材料的方形池,四面 都透光,只能用手拿棱或最上边 4、检测器 ? 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 ? 荧光的强度一般较弱,要求检测器有较高的灵敏 度,荧光光度计采用光电倍增管 ? 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度,是 因为荧光强度与激发光强度成正比,提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 ? 记录仪记录或打印机打印出结果,扫描激发光谱 和发射光谱

(二)激发光谱和荧光、磷光光谱
?

荧光和磷光均为光致发光,合适的激发光波长需根 据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下, 测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱
固定?em 荧光波长

I

获得方法:先把第二单色器的波 长固定,使测定的?em不变,改变 第一单色器波长,从200~700 nm 扫描,让不同波长的光照在荧光 物质上,测定它的荧光强度,以I 为纵坐标, ?ex为横坐标得左图, 即荧光物质的激发光谱

? ex

从曲线上找出?ex,实际上选波长较长的高波长峰

固定? ex 激发光波长

I

获得方法:先把第一 单色器的波长固定, 使激发的?ex不变,改 变第二单色器波长, 让不同波长的光扫描, 测定它的发光强度, 以I 为纵坐标, ?em为 横坐标得左图,即荧 光物质的发射光谱 从曲线上找出最 大的 ?em

? em

吸收峰
荧光峰
?

从图中看出
磷光峰

?

? 磷> ? 荧> ? 激



(三)磷光分析仪器
?

与荧光分析仪器相似,主要差异如下: 试样需在液氮温度(77K,-196℃)下测定低温 磷光(将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内) 固体表面室温磷光分析需特制试样室 有些物质既可产生荧光,又能产生磷光。用机械 切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光 寿命短,磷光寿命长消除荧光干扰。

1. 试样室
?

?

2. 磷光镜
?

六、 荧光、磷光分析及应用
(一)定量分析方法 定量分析依据 If = KC Ip = KC 1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法 ? 将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理, 配制一系列标准液,测定它们的相对发光强度。 ? 以相对荧光强度为纵坐标,以标准溶液的浓度 为横坐标 If 浓度 C1 C2 C3 荧光强度 If1 If2 If3 C4 C5 Cx I fx If4 If5 Ifx
Cx C

2. 荧光猝灭法
? ?

把荧光猝灭用在定量分析上,具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物 MQ M + Q = MQ(非荧光物质)

经推导得出:

C ( MQ) Kf ? C ( M )C (Q)

猝灭剂加入前 的荧光强度

I前 ? 1 ? K f C (Q ) I后
猝灭剂加入后试 液的荧光强度

常数

猝灭剂浓度

I前/I后与C(Q)有线性关系,可求猝灭剂含量

?

与标准曲线法相似,对一定浓度的荧光体系,分 别加入一系列不同量的猝灭剂 Q ,配成一个荧光 物质—猝灭剂体系,然后在相同条件下测定它们 的荧光强度,得一曲线
CM CQ1 I后1 CM CQ2 I后2 CM … CM CQ3 … CQx (CQ0 =0) I后3 … I后 x

取相同荧光物质 CM 加不同量Q CQ0 测 If I前 计算 I前/I后

I前/I后1 I前/I后2 I前/I后3 … I前/I后x

I前/I后 I前/I后x

CQx

CQ

3. 比较法——比较简单
? ?

如果试样数量不多,可用比较法进行测量 配一标准溶液浓度为Cs, Cs与未知液浓度Cx相 近,并在相同条件下测定它们的荧光强度 未知液

标准液
Cx ? Cs ? Cs I fx I fs

If x = KCx If s = KCs

比较

I fx I fs

Cx ? Cs

若有试剂空白,测得的荧光强度减去空白后

I fx ? I f 0 I fs ? I f 0

4. 多组分混合物的荧光分析

(1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接 测定 ? 可分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的 含量 (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光 谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产 生荧光峰,另一组分不产生荧光; ? 可选用不同的激发光进行测定

例:
Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ? ex =365nm ? em=520nm Ga3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ? ex =436nm ? em=520nm 365nm激发光, Al3+的配合物产生荧光,而Ga3+配 合物不产生荧光,无荧光峰; 436nm激发光, Ga3+ 的配合物产生荧光,而Al3+配 合物不产生荧光,无荧光峰 3+ ? 在365nm条件下激发,520nm处测Al —8-羟基喹 啉配合物,在436nm条件下激发,520nm处测 Ga3+—8-羟基喹啉配合物

(3) 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相 互干扰
?

利用荧光强度的加和性(F=F1+F2+F3+…), 在适宜的荧光波长处测定,用联立方程来 求解
? ex =385nm ? ex =410nm ? em=435nm ? em=480nm 相互干扰荧 光光谱重叠

例:硫胺荧 CT 吡啶硫胺荧CP

在385或410nm下激发, 在435和480nm下分别测荧 光强度
?

?

在385或410nm下激发,在435和480nm下分别测 荧光强度 If 435/385=26339?104CT+210 ?104CP

385nm激发

If 480/385=9685?104CT+1022 ?104CP

If =KC——K: 纯物质在选定波长下测If,求K 或410 nm激发

If 435/410=6419?104CT+252 ?104CP
If 480/410=2816?104CT+1709 ?104CP
硫胺素浓度 吡啶硫胺素浓度

(二)荧光分析法的应用
荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点 1. 无机化合物的分析 ? 无机化合物中,能直接产生荧光并应用于测定的为 数不多,但与有机化合物生成发荧光的有机配合物 后,进行荧光分析的元素达70多种,其中较常采用 荧光法测定的元素有:Be、Al、B、Ga、Se、Mg、 Zn、Cd及某些稀土元素 ?能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大 多数是芳香族化合物 ,形成五元环或六元环的螯 合物,分子的刚性平面结构增大,变为强荧光体
?

荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可 采用荧光猝灭法间接测定的离子有:F-、S2-、 Co2+、Ni2+、Cu2+等
?

2. 有机化合物的分析
?

?

脂肪族有机化合物的分子结构较为简单, 本身能发荧光的很少,一般需要与某些试 剂反应后才能进行荧光分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系, 多数能发荧光;可直接用荧光法测定。对 于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析 法是最主要的测定方法

?

为提高测定的灵敏度,有时也将芳香族化 合物与适当试剂反应之后进行测定
可测定结构复杂的大量有机物质,如:各 种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶 和辅酶以及各种药物、毒物和农药等

?

例:3,4 – 苯并芘
?

3,4 – 苯并芘为强致癌物质

煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、 焚烧垃圾都会产生3,4 – 苯并芘,汽车尾气也是主要 来源
?

食品加工过程也会产生3,4 – 苯并芘,尤其是烟熏、 油炸、烘烤食品
?

分析测定:用环己烷将3,4 – 苯并芘从试样中提取 出来,用碱将提取液的脂肪类物质皂化,然后用色谱 法分离纯化,用95%C2H5OH稀释,用荧光分光光度 计测定相对荧光强度进行定量
?

维生素B2
? ——又称核黄素,是一种生 长促进剂,常存在于动物肝 脏、肉类、蛋黄、豆类、花 生、蘑菇和海藻中, VB2易 溶于强酸或强碱性溶液。

例: VB2
CH2OH HO CH HO CH HO CH CH2 HC
3

? 在低浓度情况下,I= KC, I与C呈线性关系,在pH6~7 荧光最强

N N

N

O NH

H3C

? 在430~440nm蓝光照射下, 发出绿色荧光, ? em = 535 缺VB2会得口角炎、舌炎、 nm下测 I ,用标准曲线法 唇炎、脂溢性皮炎 测定

O

(三)磷光分析法应用
?

?

?

能产生磷光的物质数量很少,磷光分析不 及荧光分析普遍,但磷光分析法已在药物 分析、临床及环境分析领域得到一定的应 用。 低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、 苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化 合物分析 固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃 和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。

§ 5-3化学发光分析法
一、概述 ? 化学发光是利用化学反应所产生的光辐射 现象所建立的分析方法 ? 化学发光与荧光的主要区别:受激发时所 需的能量来源不同,需要化学反应过程中 所提供的化学能

化学发光分析具有以下特点
?

灵敏度高——例:用荧光素酶和三磷酸腺苷
ATP的化学发光反应,可测定低至2×10-17 mol· -1 ATP L

? ? ? ?

线性范围宽——一般有5~6个数量级 仪器设备简单,成本低廉 分析速度快,易实现自动化 局限性:可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究

二、化学发光分析的基本原理
(一)化学发光反应的基本条件 ? 发光反应必须满足以下条件 1. 化学反应必须产生足够的化学能 ? 化学发光基于化学反应提供足够的能量 A + B → C* +D 产物接受反应能被激发 C* → C + h ? ? 在可见光区观察化学发光,需170~300kJ· mol-1激 发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可 满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的 高能反应中 2. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态

(二)化学发光效率和发光强度
?

激发态分子的化学效率

化学发光效率?CL
发射的光子数 ? CL ? ? ?r ?? f 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 ? ? 参加反应的分子数 激发态分子数
激发态分子的发光效率

?r 取决于发光所依据的化学反应本身 ?f 与荧光效率的影响因素相同,既取决于发光体 本身的结构和性质,也受环境的影响

化学发光强度
?

?

具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发 光。如:萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。 非生物体的化学发光效率一般不超过1% 化学发光强度 ICL(t)与反应速度、化学发光效 率有如下关系

dc I CL (t ) ? ? CL ? dt

对下列化学发光反应

A +B →C* +D

C + h? ICL随时间和反应物消耗的变化逐渐减小

?

A + B →C* +D A为待测物质,C为发光物质,当反应物B的浓度 远远过量于待测物浓度时,B的浓度可认为是常 数。因此,发光反应可视为一级反应

dc ? k1c A dt
? ?

dc I CL (t ) ? ? CL ? ? ? CL ? k1c A dt

t 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比 化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用 发光总强度来定量分析

发光总强度

dc S ? ? I dt ? ? CL ? dt ? ? CL ? c A CL dt

三、化学发光反应的类型
1. 液相化学发光 ——研究和应用的比较广泛的有鲁米诺(Luminol) 光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。
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鲁米诺是最常用的发光试剂,它可以测定Cl2、 HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2,产生化学发光 反应时量子效率为0.01~0.05 鲁米诺(3 –氨基苯二甲酰环肼)在碱性溶液中和 H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425 nm的光辐 射

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NH2 O NH NH O

氧化剂
OH-

NH2

[
NH2

COO

]
COO COO

*

+hv
COO

425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根 吸收,处于激发状态,返回基态时发射荧光

可检测低至10-9 mol· -1 的H2O2 L

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鲁米诺H2O2的化学反应,可以被一些痕量的过渡 金属元素所催化,使发出的光大大增强,由此可 测定Co(Ⅱ),Cu(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ Ⅲ ),Ag(Ⅰ),Au(Ⅲ ),Mn (Ⅱ) , Hg(Ⅱ )Os(Ⅲ ⅣⅤ),Ru(Ⅵ),V(Ⅳ), Ir(Ⅳ)等金属离子,检测限由0.01~40 ?g· -1 mL 不等 利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量 有机和无机化合物,灵敏度都比较高 鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究, 常常涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应

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?

2.气相化学发光
——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3; NO、NO2;SO2;H2S;CO;乙烯等。 ? 在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光, 原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光 例: NO + O3 → NO2* + O2 NO2* → NO2 +h? (?≥600nm) 常温下产生化学发光,灵敏度可达1ng· -1 mL 测定范围0.01~10000 ?g· -1 mL CO + O(原子氧) →CO2* CO2* → CO2 +h? (?=300~500nm) 灵敏度为1ng· -1 mL

四、化学发光分析仪器(自学)
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气相化学发光反应主要用于某些气体的监测,有专用的监 测仪。主要讨论的是液相发光分析仪器 按进样方式分立取样式和流动注射式化学发光仪

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1. 分立取样式 ——是一种在静态下测量发光信号的装置,它利用移液管或 注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混合,或 把试剂与试样加入贮液管中,开启塞子使溶液流入反应池 中混合,化学发光反应立即发生,发光信号通过光电倍增 管检测,记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰 高进行定量分析
? ?

仪器具有设备简单,造价低,体积小,灵敏度高等优点 缺点:手工进样重复性差,测定精密度不高;难以实现自 动化,分析效率低

2. 流动注射式
——是动态测量法,试液和试剂通过蠕动泵 传送,并在流动中进样混合,恰好流动至 盘管中反应发光,流动注射式发光分析的 自动化程度、精密度和准确度都比较高, 分析速度快,适用于批量试样的测定

荧 光 形 成 机 制
单重态
第 二 激 发 态 第 一 激 发 态 内转换

三重态

体系 跨越

振 动 弛 豫

荧 光

磷 光

基 态

激发光谱和荧光光谱
荧 光 强 度

I

λex,max
300 400

λfl,max 500

λ
波长(nm)

硫酸奎宁的两个光谱

散射光的干扰示意

I

I

I

I 320 360 λnm

320

448

λnm

350

400 λnm

350

448 λnm

A

B

C

D

A,C为硫酸(0.05mol/L)在不同激发光下的干扰峰情况 B,D为硫酸奎宁在不同激发光下的荧光和干扰峰情况

荧光计示意图
样品池 光源 第一单色片 第二单色片

光电管

显示器


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