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天然药物化学

天然药物化学


第一章 总 论
? ? ? ?

第一节 绪论
第二节 生物合成 第三节 提取分离方法

第四节 结构研究法

第一节 绪
一、天然药物及其相关术语



二、天然药物化学的定义、研究对象、研究内容

三、天然药物化学发展历史沿革和现状
四、天然药物化学在中药现代化中的作用

一、天然药物及其相关术语
? ?

1.天然药物的定义: 天然来源 2.天然药物的来源:

植物

动物

矿物

微生物

海洋天然药物

3.天然药物相关术语
? ?

天然药物 natural medicine 中草药
chinese herbal medicine
《本草纲目》,1892种 / 《本草纲目拾遗》,1021种 目前我国药用植物总数,15000余种

? ? ?

中药 草药

Traditional Chinese Medicine herbal drug
蒙药 Mongolia Medicine

民族药 Ethnic Medicine

藏药
苗药
?

Tibetan Medicine
Miao drug

生药

Crude drug

4. 天然药物研究现状
?

疾病谱、医疗模式、药物结构的改变

传染、感染性疾病 —— 身心疾病、现代病
治疗 —— 预防、保健、治疗、康复

化药 —— 化药
?

天然药

国际市场对天然药物的需求日益增大 2000年全球植物药销售额,300亿美元 天然药物销售额年增长幅度,欧共体,30% 美国, 20%

日本,

15%

4. 天然药物研究现状
?

世界各地加强天然药物研发的投入

1983-1994年,上市522种新药,44%天然来源
1984-1995,FDA,31种抗癌新药,61%天然来源

93种抗感染新药,63%天然来源
?

关于天然产物的学术交流日渐活跃

二、天然药物化学的定义、研究对象、研究内容

?
?

1.定义及相关术语
2.研究对象

?

3.研究内容

1. 天然药物化学定义及相关术语:
?

天然药物化学 Chemistry of natural medicine Medicinal chemistry of natural products 运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分 (以生理活性成分或有效成分为主)

?
? ?

中药化学
植物化学

Chemistry of TCM
Phytochemistry

天然产物化学 Chemistry of natural products

2.天然药物化学的研究对象
?

研究对象:化学成分 chemical constituents
特别是生理活性成分或有效成分

active compound
?

成分的复杂性: 不同药物所含成分类型不同

每种类型成分的数目相当多
同种药物所含成分结构、性质各异

2.天然药物化学的研究对象
? ?

生理活性成分 active compound / constituent 非生理活性成分 inactive compounds

? ? ?

有效成分
无效成分 有效部位 active fraction 一种主要有效成分/一组结构相近的有效成分 有毒成分 toxic compound

?

正确理解成分的划分
?

生理活性成分并不一定真正代表有效成分

?

有效成分与无效成分的划分是相对的、发展的

A. 不同类型成分,在不同天然药物中作用不同

B. 原来视为无效成分,可能成为有效成分
C. 过去视为有效成分,被修正、完善 麝香 丹参 抗炎成分 扩冠 麝香酮————多肽 丹参醌————丹参酚酸

D. 加工、代谢等过程,可转化非活性成分为活性成分

3. 天然药物化学的研究内容
? ? ? ? ?

结构特点
理化性质

? ? ? ?

结构修饰
构效关系 生物转化 体内代谢过程等

提取分离方法
结构鉴定方法

生物合成

三、天然药物化学发展历史沿革和现状

大体分为以下3个阶段: 1. 原始和萌芽阶段(——18世纪末) 2. 学科真正形成阶段(19世纪) 3. 学科迅速发展时期(20世纪——)

1.原始和萌芽阶段(——18世纪末)
? ?

天然药物识别、使用经验——巫术、迷信色彩
文明的进步——对疾病、天然药物的认识趋于客观
231—341,晋,葛洪,《抱卜子》 1575, 1711, 明,李, 《医学入门》,没食子酸

清,洪遵,《集验方》,樟脑

1769-1786,舍勒,酒石酸、
苯甲酸、乳酸、苹果酸、没食子酸

2.学科真正形成阶段(19世纪)
?

特点一:以化学成分的发现和分离为主 1806, 阿片——————吗啡(morphine)

1820, 金鸡纳树皮———奎宁 (quinine)
1828, 烟草——————烟碱(nicotine) 1885, 麻黄——————麻黄碱(ephedrine) 吐根碱、士的宁、小檗碱,阿托品、可卡因等

2.学科真正形成阶段(19世纪)
?

特点二:结构鉴定以化学方法为主

氧化、还原等降解反应——推导结构
碎片合成、全合成————证明结构

2.学科真正形成阶段(19世纪)
?

特点三:生源合成途径、本质的揭示
生源前体的识别:萜类———MVA 生物碱——α-Aa 生源合成本质的揭示:生物细胞内多步酶促反应 有机反应理论来解释机制 生物合成物质用于结构确定

3.学科迅速发展时期(20世纪——)
?

特点一:色谱技术用于天然化合物的分离和纯化
1906,俄,Tsweet,碳酸钙为吸附剂,石油醚为洗脱剂, 1931,德,Kuhn and Lederer,氧化铝、碳酸钙为吸附剂, 1940,提出了液液色谱法,如逆流分配 1952,James and Martin,提出气液色谱理论 20世纪60年代,高效液相色谱出现

天然化合物的分离向高效、快速、微量发展

3.学科迅速发展时期(20世纪——)
?

特点二:波谱技术用于天然化合物的结构鉴定

IR: 1944,Pekin-Elmer公司,第一台红外光谱仪 MS: 20世纪,质谱仪 EI、CI,FD,FAB,ESI,MALDI ESI-TOF,MALDI-TOF NMR:1953,30MHZ的连续波核磁共振仪 70年代,脉冲傅立叶变换核磁共振仪 1D NMR——2D NMR 30—60—100—300MHz 400—500—600—800—900MHz UV,X-ray,ORD,CD等

3.学科迅速发展时期(20世纪——)
?

特点三:研究深度、广度、速度发生了革命性的变化
深度、广度:机体内源活性物质 微量、水溶性、不稳定、大分子 速度:吗啡————1804-1925 利血平———1952-1956 生物碱:1952前100年,95个 1952-1962,1107个 1962-1972,3443个

3.学科迅速发展时期(20世纪——)
?

特点四:生物活性测试普遍开展 单纯的化合物分离————活性跟踪分离

小规模测试——高通量筛选 HTS
high throungput screening

四、天然药物化学在中药现代化中的作用
?

中药发展的机遇
天然药物在健康保障体系中的作用 中药确切的疗效

? ? ?
?

相对丰富的资源

传统中药的诸多弊端
药效物质基础不明 质量难于控制——药效难于保证 剂型落后

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四、天然药物化学在中药现代化中的作用
1. 阐明中药的药效物质基础
——中药现代化系统工程的前提 2. 建立和完善中药的质量评价标准——二次开发 3. 改进中药制剂剂型——二次开发 4. 创新药物研发——原创性研发 5. 扩大药源

1.阐明中药的药效物质基础
?

探索中药防治疾病机理
麻黄 功效:发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿

物质基础:麻黄碱—肾上腺素样作用
收缩血管、兴奋中枢—发汗 去甲麻黄碱—松弛支气管平滑肌————平喘 伪麻黄碱——升压、利尿———————消肿

1.阐明中药的药效物质基础
?

促进中药药性理论研究的深入
肾上腺素
儿茶酚胺类

? 性:热性、温热药————去甲乌药碱

? 味:辛味药(解表、理气)————挥发油

? 归经:

同一归经药的相同、相似化学成分 有效成分的作用靶点:麻黄碱————解痉——肺经 伪麻黄碱———利水——膀胱经 有效成分体内代谢动力学: 川芎——川芎嗪在肝脏、胆囊分布多——归肝、胆经

1.阐明中药的药效物质基础
?

阐明中药复方配伍的科学内涵

? 单味药的有效成分研究 ? 复方有效成分 ≠ 各单味药有效成分的简单加和 ? 协同、拮抗作用 ? 物理、化学作用
?

?

改变溶出度 柴胡——人参 人参皂苷增加柴胡皂苷的溶出 甘草 甘遂 甘草皂苷增加甘遂甾萜类的溶出 发生化学反应 四逆汤:附子、干姜、甘草等 乌头碱与甘草皂苷形成不溶性沉淀——减毒 黄连 吴茱萸 小檗碱与大分子酸性成分形成沉淀

1.阐明中药的药效物质基础
?

阐明中药炮制原理
改进炮制工艺 制定炮制规范或标准

炮制前后有效成分、有毒成分的变化——阐明炮制原理

如:延胡索 ——醋炒—— 增加生物碱溶出——增效
乌头类——蒸煮——水解双酯型生物碱——减毒 黄芩——冷浸——淡黄芩(绿) ——热煮——煮黄芩(黄) 黄芩苷醌 变色

2. 建立和完善中药的质量评价标准
? ?

中药材、制剂中有效成分的质量——临床疗效
建立科学、灵敏的质控标准 科学——质控标准和药效的相关性

? ?

有效成分——科学的质控指标 多种分析手段

以有效成分、有效部位、大类成分、有毒成分为指标, 中药指纹图谱技术

?

3. 改进中药制剂剂型——二次开发
?

改革的目标:三效、三小、三便

?

剂型选择
——有效成分的溶解性、酸碱性、挥发性、稳定性等 水溶性好——注射液 口服液 颗粒剂 双黄连/参脉 生脉 板蓝根

难溶于水——片、胶囊、滴丸等
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制剂工艺优化——有效成分的理化性质 制剂稳定性——有效成分的理化性质——合适PH、适当包装

4.创新药物研发——原创性研发
?

创新药物研发的必要性

? 入世后化学药品受到专利保护,仿制须向创新转轨
? 新的药品注册法,单纯改变剂型已不能按新药申报
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创新药物研究的关键切入点:先导化合物的发现
从天然药物中发现先导物、创制新药——世界公认的有效途径 从中药中发现先导物的优势 数千年临床实践——疗效确切 丰富的资源——结构、活性的多样性

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5. 扩大药源
?
?

资源可持续可用:甘草、肉苁蓉
植物化学分类学原理:

亲缘关系近的植物含有相同或相似的化学成分
黄连素:黄连——小檗科、防己科、芸香科植物

第二节 生物合成 一、一次代谢和二次代谢
二、生物合成假说的提出 三、主要的生物合成途径

一、一次代谢和二次代谢
?

一次代谢: 对维持植物生命活动不可缺少的过程
几乎所有绿色植物中都存在 糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢、核酸代谢

?

一次代谢产物 Primary metabolits 对机体生命活动不可缺少的物质 糖、脂肪、蛋白质、核酸 乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、莽草酸、氨基酸

一、一次代谢和二次代谢
?

二次代谢:对维持植物生命活动来说不起重要作用 并非所有植物中都存在

?

二次代谢产物 Secondary metabolits
对机体生命活动并非不可缺少的物质 生物碱、黄酮、萜类、蒽醌、香豆素等

CO2 H2O 光合作用 糖 糖代谢 ATP NADPH 丙酮酸 磷酸烯醇丙酮酸 赤藓糖-4-磷酸 核糖 核酸

乙酰辅酶A 三羧酸循环
丙二酸单酰辅酶A 小分子有机酸 MVA 脂族氨基酸

莽草酸
芳族氨基酸

桂皮酸 萜类 甾体类 生物碱 苯丙素类 木脂素 木质素 黄酮类

脂肪酸 酚类 蒽醌

脂质

肽类 蛋白质

二、生物合成假说的提出
天然化合物之间的结构联系

? ?

天然化合物与一次代谢产物间的联系

二、生物合成假说的提出

二、生物合成假说的提出

三、主要的生物合成途径
1. 醋酸-丙二酸途径:脂肪酸、酚、蒽酮类

2. 甲戊二羟酸途径:萜、甾体类
3. 桂皮酸途径: 苯丙素、香豆素、木质素、木脂素、黄酮类 4. 氨基酸途径: 生物碱 5. 复合途径: 醋酸-丙二酸—莽草酸径 醋酸-丙二酸—甲戊二羟酸途径

氨基酸—甲戊二羟酸途径
氨基酸-醋酸-丙二酸途径 氨基酸—莽草酸径

脂 肪 酸 生 物 合 成

醋 酸 丙 二 酸 途 径

——

酚 类 生 物 合 成

醋 酸 丙 二 酸 途 径

——

蒽 醌 类 生 物 合 成

醋 酸 丙 二 酸 途 径

——

甲 戊 二 羟 酸 途 径

桂 皮 酸 途 径

氨 基 酸 途 径

第三节
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提取分离方法

提取前的准备

? 系统的文献调研 ? 原材料的处理 ? 保留凭证标本
?

提取分离一般原则

? 已知物或已知结构类型——文献方法,工业方法 ? 未知物——活性跟踪(定向分离)

第三节

提取分离方法

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一、中草药有效成分的提取 二、中药有效成分的分离与精制

?

一、中草药有效成分的提取
? ? ?

水蒸汽蒸馏法:挥发性 升华法 :升华性 溶剂提取法:最常用

溶剂提取法
? ? ? ?

1.选择溶剂考虑因素 2.常见溶剂的种类及其特点 3.常用溶剂提取方法 4.影响溶剂提取效率的因素

溶剂提取法

——1.选择溶剂考虑因素:
? ? ?

溶剂尽可能多地溶出有效成分,杂质少溶或不溶 有效成分、杂质、溶剂的极性:相似相溶原理 溶剂的安全性、价廉易得、回收方便等

溶剂提取法 ——2. 常见溶剂的种类及其特点
?

环己烷,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇,水

? 极性: ? 亲脂性: ? 亲水性: ? 比水重的有机溶剂: ? 与水可以以任意比例混溶的有机溶剂: ? 与水分层的有机溶剂: ? 能与水分层的极性最大的有机溶剂: ? 常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂: ? 溶解范围最广的有机溶剂:

溶剂提取法
—— 3.常用溶剂提取方法
? ?

浸渍法: 渗漉法:

?
? ?

?

水/稀醇,冷提 乙醇,冷提 提取效率高,但溶剂用量大 超声提取:各种溶剂,可加热,但所需温度低 煎煮法: 水 回流提取:有机溶剂 溶剂用量大 连续回流提取:有机溶剂,索氏提取器 溶剂反复利用

溶剂提取法
—— 4.影响溶剂提取效率的因素
? ?

溶剂 方法

?
? ?

粉碎度
温度

时间

二、中药有效成分的分离与精制
分离依据:共存成分的性质差异
? ? ? ? ?

1. 溶解度差异

2. 分配比不同
3. 吸附性差异

4.分子大小差异
5.离解程度不同

1. 根据物质的溶解度差异进行分离
? ? ? ?

调节温度 改变混合溶剂的极性 调节PH 加入某种沉淀试剂

1. 根据物质的溶解度差异进行分离
——(1)调节温度
?

温度不同——溶解度改变
结晶、重结晶
待纯化物A+杂质B、C 加MeOH热溶 热滤 滤液 (A+B) 冷置析晶 母液 (B) 结晶 (A) 残渣 (C)

1. 根据物质的溶解度差异进行分离 ——(2)改变混合溶剂极性
?

加另一种极性相差较大的溶剂——混合溶剂极性 改变——部分物质沉淀析出 A. 水/醇法:除去水提液中的水溶性杂质 B. 醇/水法:除去醇提液中的脂溶性杂质 C. 醇/醚法(醇/丙酮法):纯化皂苷

中药水提取液 加数倍量浓醇 静置过夜 母液 (目标成分) 沉淀 (水溶性杂质) (如蛋白质、多糖、果胶、粘液质)

A. 水/醇法——除去水提液中的水溶性杂质

中药醇提取液 加数倍水 静置过夜 母液 (目标成分) 沉淀 (脂溶性杂质) (如油脂、叶绿素等)

B. 醇/水法:除去醇提液中的脂溶性杂质

皂苷的醇溶液 加数倍量乙醚,静置 母液 (脂溶液杂质) 沉淀 (皂苷)

C. 醇/醚法(醇/丙酮法):纯化皂苷

1. 根据物质的溶解度差异进行分离 —— 3.调节PH
? ?

酸、碱、两性成分
调节PH——改变的分子存在状态——改变溶解度
游离型/分子态 B H+ OHOHH+ 解离型/离子态 BH+ A水溶性

HA 脂溶性

1. 根据物质的溶解度差异进行分离 —— 3.调节PH
? ?

酸、碱、两性成分
调节PH——改变分子存在状态——改变溶解度

A.酸/碱法(酸提取碱沉淀法): 生物碱的提取、纯化 B.碱/酸法(碱提取酸沉淀法): 黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化 C. 调节PH至等电点,沉淀蛋白

醇提物浸膏(B) 稀酸水提取
酸水提取液 ( BH+ ) 碱化 碱水液 (水溶性杂质) 沉淀 (B) 药渣 (脂溶性杂质)

B

H+ OH-

BH+

A.酸/碱法(酸提取碱沉淀法) ——生物碱的提取、纯化

HA

OHH+

A-

药材(HA) 碱水提取 药渣 (脂溶性杂质)

碱水提取液 ( A- ) 酸化
酸水液 (水溶性杂质)

沉淀 (HA)

B.碱/酸法(碱提取酸沉淀法) ——黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化

1.根据物质的溶解度差异进行分离

——(4)加沉淀剂
?

酸、碱成分——加入某种沉淀试剂——水不溶性盐

A.酸性成分 Pb2+、Ba2+ 、Ca2+

? 母液(?) ?

? 水悬浮,通H2S

B. 碱性化合物 苦味酸/苦酮酸,磷钼酸/磷钨酸/镭氏盐 ? 强H+ ,Et2O萃取 H2O层(?)

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
?
?

分配比K
分离因子β

K=CU / CL
β=KA / KB (KA ? KB)

上层 下层

β?100 10?β?100 β?2 β?1

1次萃取,基本分离 10?12次 100次以上 无法分离

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
? ? ?

(1)简单液液萃取法 (2)逆流分溶法( CCD, countercurrent distribution) (3)纸色谱(PC,paper chromatography)

?
?

(4)液液分配柱色谱
(5)液滴逆流色谱 (DCCC,droplet countercurrent chromarography)

?

(6)高速逆流色谱

(HSCCC,high speed countercurrent chromarography)

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 ——(1)简单液液萃取法
? ? ?

上层

β?50 A.有机溶剂/水 B.有机溶剂/酸、碱水 PH—— 物质存在状态——溶解性——K C.PH梯度萃取

下层

?

梯度调节PH,每次改变一种成分的存在状态,依次分离
?

缺点:手工操作繁琐、溶剂用量大、易乳化

例:HA1、HA2、B,且HA1 ?HA2,如何分离?
水溶液(HA1、HA2、B) 调 PH3,有机溶剂萃取 水层(BH+) 调 PH10,有机溶剂萃取 水层 有机层 (B)
-

有机层(HA1、HA2) 调 PH9,缓冲溶液萃取

PH ≥12 ≤3

B BH+

A

水层(A1 ) 有机层(HA2) 调 PH3,有机溶剂萃取 调 PH13, 缓冲溶液萃取 水层 有机层 (HA1) 水层(A2 ) 有机层 调 PH6,有机溶剂萃取 水层 有机层 (HA2)

HA

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(2)逆流分溶法
? ? ? ? ?

β<50 工作原理:多次、连续的液液萃取 craig逆流分溶仪萃取单元及工作过程 优点:避免手工操作 缺点:溶剂用量大

机械操作导致破损、漏液
乳化

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(3)纸色谱(paper chromatography, PC)

? ?

滤纸湿重/干重=2时 β= Rfa (1-Rf b) / Rfb (1-Rf a)

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(4)液液分配柱色谱 定义
? ? ?

固定相涂覆于硅胶等多孔载体上,装柱 流动相通过色谱柱进行洗脱 物质在两相溶剂中作逆流分布 —— 分配比不同,被洗脱速度不同

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(4)液液分配柱色谱
正相色谱与反相色谱
载体 正相色谱 硅胶 Si-OH 固定相 水 流动相 弱极性溶剂 适用范围 极性小的成分

硅藻土、纤维素 缓冲液 CHCl3,EtOAC,BuOH 等 CHCl3,EtOAC 部位 反相色谱 reverse phase 键合硅胶 Si-OR 石蜡油 强极性溶剂 RP-2/RP-8/ MeOH、CH3CN MeOH-H2O、CH3CN-H2O 极性大的成分 BuOH 部位

chromatography RP-18

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(4)液液分配柱色谱
加压液相色谱

? 特点
?
? ? ?

加压流动相,流速快
载体颗粒小,机械强度大,比表面极大 耐压柱材 自动检测、收集、分部

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(4)液液分配柱色谱
加压液相色谱

? 种类:
?

快速色谱 Flash chromatography 2.02×105Pa 低压液相色谱 LPLC, <5.05×105Pa

? ? ?

中压液相色谱 MPLC,
高压液相色谱 HPLC,

5.05~20.2×105Pa
>20.2×105Pa

high performance liquid chromatography

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离
——(4)液液分配柱色谱
优点 克服了简单萃取及CCD溶剂容量大、易乳化的缺点

缺点

载体可能造成化学吸附,如硅胶

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 ——(5)液滴逆流色谱 DCCC droplet countercurrent chromarography

?

流动相液滴垂直上下,经过固定相液

2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 ——(6)高速逆流色谱 HSCCC high speed countercurrent chromarography

? ? ?

行星式旋转产生的离心力场 固定性保留在蛇形管内 流动相单向、低速经过固定相

3. 根据物质吸附性差异进行分离
? ? ?

(1)吸附的类型 (2)物理吸附的基本规律 (3)极性及强弱判断

?
? ? ?

(4)简单吸附法用于物质的浓缩与精制
(5)吸附柱色谱法用于物质的分离 (6)聚酰胺柱色谱 (7)大孔吸附柱色谱

3. 根据物质吸附性差异进行分离 ——(1)吸附的类型
?

物理吸附: 分子间力,无选择性,可逆。 硅胶、氧化铝、活性炭

?

化学吸附:化学键,选择性较强,常不可逆。
硅胶——生物碱

碱性氧化铝——黄酮、蒽醌等
?

半化学吸附:氢键,选择性较弱,多可逆 聚酰胺

3. 根据物质吸附性差异进行分离 ——(2)物理吸附的基本规律
? 极性相似者易于吸附
? 极性吸附剂:硅胶、氧化铝
? 对极性物质亲和力强 ? 溶剂极性? 吸附剂对溶质的吸附力? ? 溶质可被极性强的溶剂洗脱 ? 非极性吸附剂:活性炭

? 对非极性成分吸附强
? 溶剂极性? 吸附剂对溶质的吸附力? ? 溶质可被极性弱的溶剂洗脱

3. 根据物质吸附性差异进行分离 ——(3)极性及强弱判断
?

一般物质:官能团的种类、数目、位置、碳链长短
R-COOH﹥Ar-OH﹥R-OH﹥R-NH-﹥R-CO-NH-﹥

R-CHO﹥R-CO-R?﹥R-COO-R?﹥R-O-R?﹥R-X?﹥R-H
?

溶剂:介电常数ε?,极性?
环己烷(1.88) 苯(2.29) 无水乙醚(4.47) 氯仿(5.20)
甲醇(31.2) 水(81.0) 乙酸乙酯(6.11) 乙醇(26.0)

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(4)简单吸附法用于物质的浓缩与精制 ? 活性炭吸附法

? 结晶、重结晶中脱色、脱臭 ? 从大量稀水液中浓缩微量物质——一叶秋碱的浓
缩、精制

3. 根据物质吸附性差异进行分离 ——(5)吸附柱色谱法用于物质的分离 ? 氧化铝吸附柱色谱 ? 硅胶吸附柱色谱
A.吸附剂:30~60倍,有时100~200倍 B.装柱: C.上样: D.洗脱: E.托尾: 径高比(d/h)1:15~1:20

干法装柱/湿法装柱
干法上样/湿法上样 等度/梯度(洗脱剂极性递增) 化学吸附:硅胶—碱性成分 洗脱剂中加入碱 氧化铝—酸性成分 洗脱剂中加入酸

F.洗脱系统的选择: TLC

Rf=0.2~0.3

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(6)聚酰胺柱色谱
?

高分子聚合物 不溶于常见有机溶剂 对碱稳定 对酸特别是无机酸稳定性差 可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸中

性 质

? ? ?

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(6)聚酰胺柱色谱 吸附原理

分子间氢键——半化学吸附

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(6)聚酰胺柱色谱 影 响 吸 附 力 的 因 素
? 化合物在含水溶剂中大致有以下规律:
? ?

形成氢键的基团数目:越多,越强。 形成氢键的基团所处的位置: 处于易形成分子内氢键者,减弱。 分子中芳香化程度:高,增强。

?

OH

OH

OH

HO

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(6)聚酰胺柱色谱 影 响 吸 附 力 强 弱 的 因 素
? 化合物在不同溶剂中的吸附力,随溶剂极性增强而增强
? ?

水中最强———常以水装柱、样品以水溶解上样 含水醇中次之

?

醇中最弱———常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱
EtOH-H2O最常用

? 各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力
?

水 甲醇 乙醇 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液





3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(6)聚酰胺柱色谱 醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。 脱鞣处理 生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性 与非极性化合物的分离也有用途

?

应 用

? ?

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(7)大孔吸附树脂 性质
?

原理
?

高分子聚合物

?
? ?

白色球形颗粒
多孔网状结构 不溶于酸、碱、有机溶剂
?

吸附原理:分子间 力 氢键 分子筛

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(7)大孔吸附树脂 影 响 吸 附 力 强 弱 的 因 素
? 树脂的性质:非极性树脂

易吸附非极性化合物 易吸附极性化合物

极性树脂
? 溶剂的性质:

物质在溶剂中的溶解度大,树脂对此物质的吸附力就小

3. 根据物质吸附性差异进行分离
——(7)大孔吸附树脂 洗脱剂
? ?

水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 最常用:乙醇—水 广泛应用于化合物的分离与富集工作中 如:苷类、糖类的分离

应 用

?

生物碱的精制
多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。

4.根据物质分子大小差异进行分离
?
? ? ?

透析法
超滤法

超速离心
凝胶滤过法 分子筛滤过 gel filtration: molecular sieve filtration 凝胶渗透色谱 gel permeation chromtography

4.根据物质分子大小差异进行分离
——凝胶滤过法
?

gel filtration:

凝胶三维网状结构的分子筛作用
按分子量由大到小的顺序分离

原 理
?

4.根据物质分子大小差异进行分离
——凝胶滤过法
凝 胶 的 种 类 、 性 质 及 应 用

gel filtration:

葡聚糖凝胶Sephadex G: 葡聚糖+交联剂(环氧氯丙烷) 分子筛 水中应用 分离水溶性成份 商品型号按交联度分类,以10倍吸水量(ml/g)表示 羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20: Sephadex G-25羟丙基化所得 分子筛和反相色谱相结合 水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中使用 水溶性、脂溶性成分都可分

5.根据物质离解程度不同分离进行分离
——离子交换法
离子交换原理
?

离子交换树脂为固定相,水,含水溶剂装柱

?
? ? ?

含水流动相通过树脂
可交换离子与树脂上的交换基团交换,吸附到树脂上 中性及无交换离子的成分流出 将吸附到柱上的成分洗脱下来

5.根据物质离解程度不同分离进行分离
——离子交换法
离子交换原理
?

离子交换树脂为固定相,水,含水溶剂装柱

?
? ? ?

含水流动相通过树脂
可交换离子与树脂上的交换基团交换,吸附到树脂上 中性及无交换离子的成分流出 将吸附到柱上的成分洗脱下来

5.根据物质离解程度不同分离进行分离
——离子交换法
离子交换树脂的性质 离子交换树脂的结构
?

球形颗粒,不溶于水,可在水中溶胀

? ?

母核

离子交换基团

5.根据物质离解程度不同分离进行分离
——离子交换法
离子交换树脂的种类
?

?

阳离子交换树脂:强酸性(-SO3-H+) 弱酸性(-COO-H+) 阴离子交换树脂:强碱性(-N+(CH3)3Cl-) 弱碱性(-NH2,-NH-,-N=)

5.根据物质离解程度不同分离进行分离
——离子交换法
离子交换树脂的应用
?

不同电荷离子的分离 如水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离

?

相同电荷但解离程度不同离子的分离

如碱性不同的生物碱的分离

水提液 强酸性阳离子交换树脂 流出液 (酸性、中性成分) 强碱性阴离子交换树脂 流出液 (中性成分) 树脂 (酸性成分) 流出液 (碱性成分) 树脂 (两性成分) 树脂 (碱性、两性成分) 氨水洗脱 洗脱液 强碱性阴离子交换树脂

水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离

水提液 弱酸性阳离子交换树脂 流出液 树脂(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ) 水洗脱 洗脱液 (Ⅰ)
Ph N CH3


碱性 Ⅰ<Ⅱ < Ⅲ
O O CO CH

树脂(Ⅱ、Ⅲ) NH4Cl 洗脱 洗脱液(Ⅱ) 树脂(Ⅲ) Na2CO3 洗脱

CH2OH



Ph N CH3 O CO CH CH2OH

洗脱液(Ⅲ)

树脂


O N+OHOCH3 OCH3

碱性不同的生物碱的分离



第四节 结构研究法
? 结构研究的特点:难于合成品
? 结构研究的总原则: 尽可能不消耗或少消耗试样 波谱综合分析 与文献数据比较 必要时辅以化学手段

第四节 结构研究法
? ? ? 一、纯度的测定 二、结构研究的主要程序 三、结构研究中采用的主要方法

一、纯度的测定
? ? ? ? 纯度检查法: 均一的晶形 敏锐的熔点、沸点、折光率、比旋度 TLC、PC、GC、HPLC

二、结构研究的主要程序

三、结构研究中采用的主要方法
? ? ? ? 确定分子式,计算不饱和度 质谱 (MS,mass spectrum) 红外光谱(IR,infrared spectra) 紫外-可见吸收光谱(UV-vis) (ultraviolet-visible spectra) ? 5. 核磁共振(NMR,nuclear magnetic resonance) ? 6. 其他: x-单晶衍射法 旋光光谱(ORD) 园二色谱(CD) 1. 2. 3. 4.

三、结构研究中采用的主要方法

—— 1. 确定分子式,计算不饱和度
? ? ? ? 分子式的确定 元素定量分析结合分子量测定 同位素丰度比法 高分辨质谱(HR-MS,high resolution mass spectrum )

? 不饱和度的计算 ? u=Ⅳ-Ⅰ/2+Ⅲ/2+1

Ⅰ:一价原子数 如H、X Ⅲ:三价原子数,如N、P Ⅳ:四价原子数,如C

三、结构研究中采用的主要方法

—— 2. 质谱 (MS,mass spectrum)

? 作用:
? 确定分子量、分子式 ? 提供部分结构信息 ——丢失碎片的大小 如15、17

——碎片的m/z及裂解方式

三、结构研究中采用的主要方法

—— 2. 质谱 (MS,mass spectrum)
? 常用质谱技术及特点

? 电子轰击质谱(EI-MS,electron impact ionization) ? 场解析质谱(FD-MS,field desorption ionization) ? 快速原子轰击质谱(FAB-MS,fast atom bombardment) ? 电喷雾质谱(ESI-MS,electrospray ionization)

? 基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)
matrix-assisted laser desorption ionization

常用质谱技术及特点——电子轰击质谱(EI-MS) (electron impact ionization)

? 样品需加热气化,离化,得到M+ ? 难气化、易热解的成份测不到M+ 如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素

常用质谱技术及特点——场解析质谱(FD-MS)

field desorption ionization
? 试样稀液涂于钨丝上作阳极,对面加阴极,通高压,使电离 ? 难气化、易热解的成份,可得到

分子离子相关峰:[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+
逐个脱去糖基的碎片峰:[M+H-162]+、[M+H-162-146]+ ? 苷元的碎片离子相对少

常用质谱技术及特点——快速原子轰击质谱(FAB-MS)

fast atom bombardment
? 离子枪发射高能离子与另一中性粒子碰撞,交换电荷, 形成高速中性粒子,与样品碰撞,使其电离

? 难气化、易热解的成份,可得到
分子离子相关峰:[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+

逐个脱去糖基的碎片峰:[M+H-162]+、[M+H-162-146]+
? 可得到苷元的碎片

常用质谱技术及特点——电喷雾质谱(ESI-MS)

electrospray ionization

? 强静电场使试样电离, ? 难气化、易热解、大分子、小分子,均可得到 分子离子相关峰:[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+

常用质谱技术及特点——基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)

matrix-assisted laser desorption ionization

? 用于研究结构复杂,不易气化的大分子物质的分子量 如多糖、蛋白、核酸等

三、结构研究中采用的主要方法

—— 3. 红外光谱(IR,infrared spectra)
? 原理: 化学键的振动在红外光区(4000~625cm-1)引起的吸收谱图 ? 作用: ? 特征频率区(functional group region) 4000~1500 cm-1————确定官能团类型 ? 指纹区(fingerprint region) 1500~600 cm-1————构象、构型、取代模式等

三、结构研究中采用的主要方法 —— 4. 紫外-可见吸收光谱(UV-vis) (ultraviolet-visible spectra)
? 原理 电子由基态跃迁至激发态(????、n???) 在紫外可见光区(200~700nm)引起的吸收谱图 ? 作用 ? 对含有共轭双键、α,β-不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定有重要价值 ? 特定的吸收谱特征——骨架类型的判断

如:黄酮、香豆素、蒽醌
? 加诊断试剂前后谱图的规律性变化——取代图式的推断 如:黄酮、香豆素

三、结构研究中采用的主要方法 ——5. 核磁共振(NMR) (nuclear magnetic resonance)
? 原理:
1H、13C等具有磁矩的原子在外加磁场中受电磁波照射,吸收

一定能量电磁波,产生能级变化,引起核磁共振

? 氢核磁共振(1H-NMR) ? 碳核磁共振谱(13C-NMR) ? 二维核磁共振谱 (2D-NMR)

氢核磁共振(1H-NMR)
? ? 应用: 提供H的类型、数目、相邻原子团的信息 ——H的类型 四个参数: 屏蔽效应

? 化学位移(?):1~10~20ppm

? 积分值/积分面积
? 自旋偶合裂分的峰数 符合 n+1律 ? 偶合常数(J) 二面角:

———同一环境下H的个数
———邻位与其不等同的H的个数 s, d, t, q ———H核间的距离

相隔键数: 越少,J大,通常为3JH-H 越接近90°,J越小 越接近0°、180°,J越大

氢核磁共振(1H-NMR)
? 远程偶合(4JH-H):
Ha

芳环上的偶合
Hb

烯丙偶合
Hb C Ha C C Hc

Hc Hd

Jac=1.6~2.0Hz Jbc=0~1.5Hz

Jab=6~10 Hz Jac=1~3Hz Jad=0~1 Hz

氢核磁共振(1H-NMR)
? 同核去偶技术(homodecoupling): 消除或部分消除相邻H核的偶合,简化图谱 CH3CH2OCOCH3
CH3 CH2 CH3 t q s 照射H-2 照射H-1 s s

碳核磁共振谱(13C-NMR)
? 最重要的参数:
化学位移?:1~200ppm ——C的类型 ?
13C的信号裂分 13C-NMR:异核偶合——1H-NMR:同核偶合

? 偶合裂分峰数:——C的级别 符合n+1律,s, d, t, q, ? 有1JC-H
2J C-H 3J C-H

碳核磁共振谱(13C-NMR)
? 常见碳谱类型及特征: ? 噪音去偶谱(proton noise decoupling spectrum) 全氢去偶(COM,proton complete decoupling) 宽带去偶(BBD,broad band decoupling)

? 选择氢核去偶谱(SPD)
selective proton decoupling spectrum 远程选择氢核去偶谱(LSPD) long range selective proton decoupling spectrum ? 无畸变极化转移增强法(DEPT)

distortionless enhancement by polarization transfer

常见碳谱类型及特征——噪音去偶谱

? 噪音去偶谱(proton noise decoupling spectrum) 全氢去偶(COM,proton complete decoupling) 宽带去偶(BBD,broad band decoupling)

? 宽频照射,消除所有H对C的偶合 ? 谱中所有C均为s ? 无对称因素强况下,谱中信号数即C数

常见碳谱类型及特征——选择氢核去偶谱 远程选择氢核去偶谱
? 选择氢核去偶谱(SPD)
selective proton decoupling spectrum 远程选择氢核去偶谱(LSPD) long range selective proton decoupling spectrum ? 照射某个或某几个H,消除部分H对C的偶合

? 谱中,与被照射H偶合的C信号不同程度简化

以9-C为例

常见碳谱类型及特征——无畸变极化转移增强法
? 无畸变极化转移增强法(DEPT)

distortionless enhancement by polarization transfer
? 改变照射1H的脉冲宽度(?) ? 所有13C信号均为单峰 ? 不同类型13C分别呈正峰、倒峰

? 如? =45°,CH,CH2,CH3 正峰 ? ? =90°,CH 正峰 ? ? =135°,CH,CH3,正峰,CH2 倒峰

二维核磁共振(2D-NMR)
? 1H-1H相关谱 (1H-1H COSY)
1H-1H

correlation spectroscopy

? 13C-1H相关谱 (13C-1H COSY)
——异核多量子相关谱(HMQC) (1H-detected heteronuclear multiple quantum coherence)

? 13C-1H远程相关谱( Lr. 13C-1H COSY)
——异核多键相关谱(HMBC) (1H-detected heteronuclear multiple bond corerelation)

二维核磁共振(2D-NMR)

——1H-1H相关谱
?
?

(1H-1H COSY)

对角峰:同一个1H出现对角峰
相关峰:相互偶合的1H出现相关峰

?

用来归属相互偶合的1H信号,推断官能团的连接方式

对角峰

相关峰

二维核磁共振(2D-NMR) ——13C-1H相关谱 (13C-1H COSY)
? 异核多量子相关谱(HMQC)
? 1JC-H ,1H和与其直接相连的13C出现相关峰 ? 用来进行信号归属,判断碳的级别

HO 4 5

3

OH 2 17 6 H H 8 C O 9 9' COOH 8' OH O C H 2' 3' 1' CH2 OH 4' 7' 6' 5'

二维核磁共振(2D-NMR) ——13C-1H远程相关谱 (Lr.

13C-1H

COSY)

? 异核多键相关谱(HMBC)
? 3JC-H ,1H和与其相隔3个化学键的13C出现相关峰

? 用来进行信号归属,判断碳的级别

HO 4 5

3

OH 2 17 6 H O H 8 C 9 9' COOH 8' OH O C H 2' 3' 1' CH2 OH 4' 7' 6' 5'


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