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4第四章 目的基因的制备3_图文

4第四章 目的基因的制备3_图文


第四章 目的基因的制备

第三节 目的基因的分离

构建基因文库


依据待分离目的基因的特性 筛选分离出含有目的基因的 特定克隆子
特性:基因的序列、功能、在染色体上 的位置和转录产物mRNA等。

一、目的基因的功能克隆
(一)根据特异蛋白分离目的基因
路线1 核酸探针 分离特异蛋白 路线2 抗体筛选
作为抗原

测定特异氨基酸序列

推测编码蛋白的核苷酸序列

用免疫动物制备抗体

人工合成寡核苷酸片段探针

特异抗体筛选cDNA表达文库

从氨基酸顺序来指导合成寡核苷酸探针
注意:
? 1、设计的寡核苷酸探针必须能特异地识别目

的基因,这种能在整个真核cDNA文库中与单一
顺序特异结合的寡核苷酸探针的最短长度为 15-16个核苷酸,但通常使用17-20个核苷酸的 长度,即至少需要了解蛋白质肽链上6个连续 的氨基酸顺序。

? 2、由于遗传密码的简并性(degeneracy),大

多数氨基酸有2种或2种以上的遗传密码,有的 可多至6种,因此,一种氨基酸存在多种可能

的DNA顺序。
? 为了获得全部可能的顺序,通常要合成一组混

合的寡核苷酸探针,其中只有一种探针能与目 的基因完全互补。容易出现“假阳性”。

合成寡核苷酸
? 合成少数几种、甚至一种较长的寡核苷酸,一般

为35-75个核苷酸探针。
? 选择密码子简并性尽可能少的蛋白质顺序,或者

根据不同生物密码子使用频率的知识加以推测,

由此,得到的探针称为“猜测体”(guessmer)。

? 多肽顺序测定已知脲酸盐氧化酶(urate

oxidase)的32个氨基酸顺序,根据这一氨基酸 顺序,在它的两端设计了两组简并寡核苷酸引物。 实验先提取mRNA和反转录合成单链cDNA,然 后用这两组引物进行PCR,扩增出的片段插入载 体和转化E.Coli。实验再根据32肽的中间顺序设 计一个猜测体探针,从转化菌落中筛选出一个阳 性克隆,进而以该克隆的cDNA插入片段作为探 针,在非常严谨的条件下从cDNA文库中筛选出 全长2.2kb的编码脲酸盐氧化酶的cDNA。

已知脲酸盐氧化酶的32个氨基酸顺序
提取mRNA 简并寡核苷酸引物。 反转录合成

单链cDNA
简并寡核苷酸引物。 PCR,扩增 目的基因DNA

插入载体 猜测体探针 转化E.Coli

阳性克隆

cDNA插入片段作为探针 严谨的条件下从cDNA文库中筛选出全长2.2kb的编码脲酸盐氧化酶的cDNA

利用抗体筛选目的cDNA
? 1、构建cDNA表达文库 ? 2、以融合蛋白的形式表达目的基因

? 3、考虑cDNA片段在表达载体中的方向和阅

读框架问题,保证cDNA的正确表达

根据特异蛋白分离目的基因的局限性
特异蛋白的鉴定与分离纯化; 某些基因产物的表达量非常微少,相关蛋白难以 分离纯化或量不足; 并非所有基因都有蛋白产物,如tRNA基因; 仅少数基因能表达形成相应蛋白质,且不同时期、 不同条件下蛋白质的种类不完全相同; 由于遗传密码简并性,难推导出十分特异的探针。

(二)功能互补法克隆基因
它主要是利用被克隆的DNA片段与寄主细胞

的染色体DNA在功能上有同源互补性来进行目的
基因直接分离的。

一种最简单的方式是,将大肠杆菌DNA的克隆

片段“库”中的重组DNA分子分别导入一种
大肠杆菌营养缺陷型菌株(auxotrophic

strain)的受体细胞
↓ 然后将受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要 的营养底物的基本培养基上 ↓ 结果只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受 体细胞才会长成转化子菌落。

酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的克隆
Eco RⅠ部分酶解面包酵母基因组得到许多DNA片段 ↓ DNA片段与λ噬菌体载体重组 ↓ 转入吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型大肠杆菌菌株 ↓ 在不含组氨酸营养源的基本培养基中培养 ↓ 只有引入了吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的细菌才能生长

二、序列克隆法
(一)根据已知基因序列或同源基因序列分离目的 基因

根据已知基因序列或同源基因序列制备探针 ↓ 筛选基因文库 ↓ 对阳性克隆测序 ↓ 与已知基因序列或同源基因序列比较 ↓ 经转化鉴定是否为待分离的基因

应 用 核 酸 探 针 筛 选 λ 噬 菌 体 文 库

碱处理破 坏外壳蛋 白,保留 DNA

(二)表达序列标签法(ESTs)分离目的基因
Adams等(Adams et al.,1991)首次提出

表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)
基因序列中,一段能特异的标记或表征基因的序列, 它有足够的信息显示该基因与其它基因的差异,长度 200-600bp。 EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA 文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

利用EST寻找新基因的方法即表达序列标签法(ESTs)

不同组织cDNA文库,随机挑选克隆并部分测序(EST)

EST序列对GenBank、EMBL数据库检索

目标基因或多肽序列,分析已报道信息 文库筛选或基因定位分 离目的基因 结合生物信息学的手段,为人们提供一种快 速有效的发现新基因的方法

EST策略的局限性
① 难寻找出一些表达量极低或不表达的新基因

类型
② 不能检测出许多重要基因的内含子序列和调

控序列
③ 不能确定克隆基因的功能 ④ 只能检测已表达的基因,不能获得全部基因

信息

三.筛选目的基因的差别杂交及减法杂交技术 1、差别杂交法
也称为差别筛选法,特别适用于分离在特定组

织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长
因子调节的基因,亦可有效地用来分离经特殊

处理诱导表达的基因。

原理:利用一对组织对基因表达的差异,筛选 出在其中一种组织中受某种因素调控表达的一

种或一组基因。

应用前提: 1

两种不同细胞群体 2 目的基因 不表达

目的基因 表达

分别制备以上两种细胞群体的总mRNA提取物

差 别 杂 交 法 的 操 作 步 骤

以这两种总mRNA为探针,分别筛选 由细胞群体1构建的cDNA文库

以细胞群体1的mRNA 为探针 包含目的基因的 菌落呈阳性反应

以细胞群体2的mRNA 为探针 不包含目的基因的 菌落呈阳性反应

对照原平板,挑选含目的基因的菌落

差别杂交法局限性:
1

灵敏度低,不适于分离低丰度mRNA的目的基因

2

筛选大量杂交滤膜,鉴定大量噬菌斑,费时耗力

3

差别杂交重复性差

2、减法杂交技术
又称差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂 交或消减杂交等。 本质:尽量消除两种样品共同存在的基因 序列,从而有效富集目的基因序列。

减法杂交
对象 cDNA

基因组DNA

分类

mRNA减法杂交

基因组DNA 减法杂交

用途

分析两样品中 差异表达的基因

克隆两样品中 特异性存在基因

(1)mRNA减法杂交
目的基因 表达 组 织 1

目的基因 不表达

基 本 原 理
提取mRNA并反 转录为cDNA

组 织 2

+
过量 杂交

提取mRNA

两组织中均表达的基 因产物将形成 cDNA/mRNA杂交分子

特异mRNA反转 录的cDNA仍单链 差异表达序列

四、利用差示分析法分离目的基因克隆
1、mRNA差别显示技术(差别显示反转录PCR)
(mRNA differetial display by PCR,DD-PCR)

CAP-5’

mRNA

AAAAAAA NMTTTTTTT

PCR扩增引物
3’端引物:T11MN或T12MN

M-A/C/G N-A/T/C/G

共12种

5’端引物:10个核苷酸的随机引物(AP) 共20种

共 240 对

优点:
① 可检测表达的

缺点:

① 检测全部mRNA的PCR工作
量很大; ② PAGE分离的cDNA大于 500bp时会漏检,凝胶分析 最多为50-100条;

所有基因;
② 同时检测基因

的上调和下调
表达、展现所 有差异、比较 多种细胞类型;

③ 差别条带成簇时造成假阳
性; ④ Northern印迹繁杂费时; ⑤本底较高。

五、功能结合法筛选目的基因
原理:根据目的基因表达产物的其他结合
功能,如受体与配体结合、酶与底物结合

等完成目的基因的分离筛选。

六、根据生物大分子间的相互作用分离 目的cDNA克隆
酵母双杂合系统p254 真核生物的位点特异转录激活因子:BD AD


将一cDNA文库或基因片段与编码AD的基因融合, 将其转化入可表达BD融合蛋白的酵母体内。

路线1 注意问题
寡核苷酸探针可特异地识别目的基因,其长度 应为17-20个核苷酸,即至少需要了解蛋白质 肽链上6个连续的氨基酸顺序。 由于遗传密码的简并性,一种氨基酸顺序存在 多种可能的DNA 顺序。为了获得全部可能的顺 序,通常要合成一组混合的寡核苷酸探针,其 中只有一种能与目的基因完全互补。易出现 “假阳性”(错误的探针与无关cDNA发生杂 交)。

可合成较长的“猜测体”探针。

路线2 注意问题
构建cDNA表达文库(使用表达型载体)。

以融合的形式表达目的基因(稳定、高效)。
保证cDNA的正确表达。

根 据 氨 基 酸 序 列 合 成 寡 核 苷 酸 探 针

用 抗 体 筛 选 目 的 c

D N A

重 组 体 克 隆 的 差 别 杂 交 筛 选 法

用 差 示 杂 交 筛 选 血 清 诱 导 表 达 基 因

生 长 因 子 调 节 基 因

减 数 杂 交 分 离 T 细 胞 受 体 基 因

(3)基因组 DNA 减法杂交
生物素标记

用来分离缺失 突变基因

减 法 杂 交 分 离 缺 失 突 变 体 基 因

回收 cDNA, 制备探 针筛选 文库, 以分离 该差异 片段对 应的全 长cDNA 或完整 基因

差 别 显 示 分 析 基 本 流 程

红细胞生长分化因子(又称促红细胞生成素EPO) 受体cDNA的克隆筛选

诱饵蛋白

靶蛋白

带有一个或多个报告基因的宿主菌株 酵母双杂交体系原理


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